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[研究背景和意义]炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类慢性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。近年来,IBD在国内外的发病率逐渐增高,已成为危害人体健康的消化系统常见疾病,但是,迄今仍然缺乏治疗炎症性肠病的特异性药物,究其原因主要是炎症性肠病的病因和发病机制不清楚。血浆激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin system,KKS)是一组与生理病理刺激和组织损伤密切相关的血浆蛋白,包括两种丝氨酸蛋白酶,即凝血Ⅻ因子(factor Ⅻ,FⅫ)与血浆前激肽释放酶(prekallikrein,PK),以及它们的共同底物高分子量激肽原(high-molecular-weightkininogen,HK)。根据以往的体外研究,当KKS成员与阴离子表面结合并组装时KKS可被活化,首先FⅫ自身发生活化,裂解为活化的FⅫa,FⅫa使前激肽释放酶(PK)活化生成激肽释放酶(kallikrein,Kal),FⅫa与Kal均可以裂解底物HK,产生活化型高分子量激肽原(HKa),并释放缓激肽(BK),HKa和BK均具有促炎症反应作用。以往的研究资料表明,IBD患者和结肠炎动物模型均存在血浆KKS的活化,提示血浆KKS参与炎症性肠病的发病,但是迄今对于KKS在IBD发病中的确切作用和机制仍不清楚。[研究目的]判定血浆KKS在IBD发病中的作用,并研究其作用机制。[研究方法](1)为了判定血浆KKS在IBD发病中的作用,我们构建了两种新的KKS基因敲除小鼠模型,即血浆HK缺失的Kng1基因敲除小鼠以及血浆PK缺失的Klkb1基因敲除小鼠。(2)给野生型和KKS敲除小鼠连续饲喂含有2.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水8天,构建DSS诱导的结肠炎模型,通过每日给小鼠称重,检测小鼠腹泻与便血情况,计算疾病活动指数。(3)给小鼠直肠灌注3 mg2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),构建TNBS诱导的结肠炎模型。(4)用激肽释放酶抗体治疗DSS诱导的小鼠结肠炎。(5)利用ELISA的方法,检测血浆BK与C5a的浓度,结肠组织炎症因子与髓过氧化物酶(MPO)的水平。(6)利用实时定量PCR的方法,检测结肠组织中炎症因子的水平。(7)分离小鼠结肠粘膜固有层细胞,利用流式细胞术分析中性粒细胞(CD45+CD11b+Gr1hi)的占比。(8)制作结肠组织的石蜡切片,进行H&E染色,观察结肠组织的病理变化。(9)通过Western blotting方法,检测血浆HK蛋白的裂解。(10)利用特异性化学发光底物S2302,检测激肽释放酶的酶活性。[研究结果](1)DSS处理的野生型小鼠血浆BK水平明显升高,并且血浆APTT时间延长,提示血浆KKS发生活化。(2)与野生型小鼠相比,血浆HK、PK以及缓激肽受体的缺失可以缓解DSS诱导的结肠炎的发病,而FⅫ缺失的小鼠在DSS诱导的结肠炎模型中没有表型。(3)Kal特异性抑制剂明显缓解IBD的临床表型和病理变化。(4)激肽释放酶可以刺激单核细胞表达细胞因子,切割C5产生C5a。(5)DSS可以活化PK并导致HK的裂解及BK的产生。(6)在TNBS诱导的结肠炎发病中,血浆PK-HK-BK途径同样发挥重要作用。[研究结论]血浆激肽释放酶-高分子量激肽-缓激肽途径在炎症性肠病的发病中发挥关键作用,激肽释放酶具有成为临床IBD治疗新靶点的潜力。