论文部分内容阅读
瞬时感受器电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是近年来发现的存在于细胞膜或胞内细胞器膜上的一类与多种感受功能有关的非选择性阳离子通道蛋白,该通道可被多种理化因素激活,主要有辣椒素、大于43℃的热刺激和质子等,且被激活时主要引起Ca2+的大量内流,以胞内Ca2+浓度增高的形式调节着相应的生理功能或病理机制的发生。本研究室以往的研究结果显示,下丘脑体温调节中枢的TRPV1在机体发热过程中对限制体温升高具有重要的作用。
前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是一种重要的中枢性发热介质,在参与体温调节时在脑内最敏感的作用部位是视前区-下丘脑前部(the preoptic area of the anterior hypothalamus,PO/AH)。
本实验通过采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)复制大鼠发热模型,结合应用特异性TRPV1通道阻断剂AMG9810,观察不同实验条件下体温的变化、视前区-下丘脑前部组织中TRPV1表达量、细胞内钙离子浓度变化及PGE2含量的变化,通过检测TRPV1对中枢发热的正调节物质PGE2产生的作用,探讨发热时TRPV1限控体温的相关中枢机制。
材料与方法：
一、实验动物及处理
选用健康雄性SD大鼠48只,体重250～280g,基础体温(38.1±0.2)℃,由中国医科大学实验动物中心提供。饲育室室温(20±2)℃,相对湿度40%-60%,昼夜光照节律12h:12h,单笼饲养,自由进食水。实验中各项操作按常规无菌操作规则进行。将48只大鼠随机分成4组:(1)正常对照组(N):12只,下丘脑PO/AH中注射溶剂0.1μl(溶剂为1.5%无水乙醇+98.5%生理盐水),30min后腹腔注射生理盐水4ml·kg-1;(2)AMG9810组(A):12只,下丘脑PO/AH中注射AMG9810,按6μg·kg-1‘配置成0.1μl(用1.5%无水乙醇+98.5%生理盐水配置)(TOCRIS,USA),30min后腹腔注射生理盐水4ml·kg-1;(3)LPS发热组(L):12只,下丘脑PO/AH中注射溶剂0.1μl,30min后腹腔注射LPS4m1·kg-1(20μg·ml-1,用生理盐水配制)(Sigma,USA);(4)AMG9810+LPS组(A+L):12只,下丘脑PO/AH中注射AMG98100.1μl,剂量同前,30min后腹腔注射LPS4ml·kg-1。下丘脑PO/AH区插管采用10%水合氯醛3ml·kg-1腹腔麻醉下,参照大鼠脑图谱(A Stereotaxic Atlas of the Rat Brain)进行。
各组取6只动物持续观察体温变化360min,并描绘其体温变化曲线。在各实验条件下分别各取6只动物,N组和L组在腹腔注射240min时,A组和A+L组在腹腔注射300min时立即断头取动物下丘脑PO/AH区组织,检测PGE2含量、[Ca2+]I及TRPV1表达。测试样品的采集及处理如下:断头打开颅骨顶,暴露脑组织,按大鼠脑图谱以灰结节和视交叉的中心点为界定部位,取出下丘脑PO/AH部位,一部分立即进行细胞内钙离子浓度测定,一部分立即投入液氮中速冻固定,20min后放入-80℃冰箱内待测。
在麻醉状态下,于大鼠腹腔植入遥测系统发射子。应用BW-200生理无线遥测系统测量大鼠体温,每隔5分钟自动记录体温一次,直到实验结束。数据输入计算机进行处理,测算出△T,△T为即时体温与基础体温之差。
二、脑内PGE2含量的测定
大鼠处死后,迅速取出下丘脑PO/AH、大脑皮质各30mg,立即投入液氮中速冻固定,20min后放入-80℃冰箱内待测。检测时将标本融化后保持在2-8℃,加入适量PBS(pH7.4),置于玻璃匀浆管内,将标本制成匀浆,离心3000r·min-1,20min,取上清置-20℃保存待测。按照大鼠PGE2酶联免疫分析试剂盒使用说明书进行测定(R&D,USA)。PGE含量用(ng·L-1)表示。
三、下丘脑PO/AH细胞内钙离子浓度([Ca2+]I)测定
分离出下丘脑PO/AH组织,制备成单细胞悬液,保持细胞存活率须在95%以上。然后Fura-2/AM避光孵育负载,调激发波长340nm,发射波长510nm,采用日立F-4500型荧光双波长分光光度计测定。
四、Western blot检测下丘脑PO/AH中TRPV1表达
取大鼠下丘脑PO/AH组织,冰浴匀浆,4℃离心(13000r·min-1,60min)两次,取上清。进行蛋白定量后,电泳、转膜、封闭,加小鼠抗大鼠TRPV1单克隆抗体(1:1000),二抗为羊抗小鼠IgG,ECL化学发光法显色,凝胶成像图像分析系统分析。对照选用抗β-动蛋白抗体(β-actin)。目的蛋白与相应β-actin蛋白的灰度比值作为该目的蛋白的相对表达量。
五、统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,所有实验数据均用均数±标准差(-x±s)表示。各组体温变化最大值、PGE2含量、细胞内钙离子浓度和TRPV1表达的比较采用单因素方差分析,两两比较方法选用LSD法。
实验结果：
一、各实验组大鼠体温的变化
各组在实验过程中体温变化最大值(△Tmax)分别为N组:0.31±0.11℃(300min),A组:0.46±0.21℃(240min),L组:1.18±0.34℃(240min),A+L组:1.95±0.49℃(300min)。N组和A组比较体温变化差异无统计学意义(P＞0.05)。大鼠腹腔注射LPS可引起体温升高,于240min左右大鼠体温达到高峰,之后体温缓慢回降。当预先给PO/AH部位注入AMG9810,30min后腹腔注射LPS时,即在A+L组体温变化也出现明显升高,在300min左右体温达到高峰,之后体温回降。与L组比较,A+L组发热幅度升高,在270～360min期间,两组△T差异有统计学意义(P＜0.05)
二、下丘脑PO/AH中PGE2含量的变化
各组在体温达高峰时大脑皮质中的PGE2含量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。在L组和A+L组PO/AH区域中的PGE2含量分别382.06±6.65和416.65±9.48,与N组的277.78±3.77和A组的274.24±6.27比较差异均有统计学意义(P＜0.01),A+L组PO/AH区域中的PGE2含量高于L组,差异有统计学意义(P＜0.01),但N组与A组PO/AH区域中PGE2含量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
三、下丘脑PO/AH神经元中[Ca2+]i的变化
N组下丘脑PO/AH神经元中钙离子浓度为250.04±11.8l,A组为246.21±16.10,L组为365.50±5.00,A+L组为302.11±13.00。L组和A+L组PO/AH神经元中钙离子浓度与N组和A组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),A+L组低于L组,差异有统计学意义(P＜0.01),但N组与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
四、下丘脑组织TRPV1表达的变化
L组和A+L组大鼠下丘脑PO/AH中TRPV1蛋白表达水平与N组和A组比较差异均有统计学意义(P＜0.01),并且L组大鼠下丘脑PO/AH中TRPV1蛋白表达水平高于A+L组,差异有统计学意义(P＜0.05),但N组和A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论：
1、应用TRPV1特异性阻断剂AMG9810对正常体温水平没有明显的影响。
2、发热过程中,体温升高到一定程度可诱导下丘脑TRPV1的表达和开放,TRPV1通过下丘脑细胞内Ca2+浓度升高,使下丘脑PO/AH中的PGE2含量减少,这可能是机体发挥限热作用的途径之一。