一、目的：编码LINGO-1的基因位于人类染色体15q24.3。LINGO-1是具有富亮氨酸重复结构和免疫球蛋白结构域的NOgO受体作用蛋白。REMBRANDT数据库提示,胶质瘤中LINGO-1的表达水平明显低于正常脑组织,相比于平均水平,LINGO-1下调的病例生存期要明显下降。通过对全球范围基因芯片结果的Meta分析,旨在寻找胶质瘤的潜在靶标,2013年RheaI A T等发表在Neuro-Oncology上的文章中指出,通过免疫组织化学染色,确定了五个在胶质瘤发生中表达水平显著改变的分子,包括：spondinl,Plexin-B2,SLIT3,fibulin-1,and LINGol。而基于免疫组织化学染色结果, LINGO1被认为是最具有神经系统特异性的靶标,尤其是随着胶质瘤级别增高,其重要性尤为突出。本文旨在研究LINGO-1对于胶质瘤,尤其是恶性胶质母细胞瘤是否存在肿瘤抑制作用,假如LINGO-1是肿瘤抑制因子,那么LINGO-1又是通过什么样的机制达到肿瘤抑制作用?综上所述,我们在本阶段实验中将对这一猜想进行研究与阐述。二、方法：首先我们根据分子克隆的原则,构建慢病毒载体,携带LINGO-1 FL(全长)或者LINGO-1 Ecto(胞外段)序列,然后,我们使用不同胶质瘤细胞系(U251/U87MG)作为实验载体,并以此慢病毒感染U251/U87MG,此方法可以将目的基因序列转导入目的细胞内,并使被感染的细胞稳定地过表达LINGO-1 FL或者LINGO-1 Ecto。 U251/U87MG感染慢病毒后,我们抽提了细胞总蛋白,并进行LINGO-1 FL或者LINGO-1 Ecto过表达的验证。我们检测了感染慢病毒细胞系的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和成瘤的能力。另外,我们也使用LINGO-1的激动剂有效激动LINGO-1,并进行了一系列相应的功能实验,包括增殖、迁移、侵袭、克隆形成和成瘤实验。在抑癌机制研究中,我们通过细胞免疫荧光染色和蛋白免疫印迹方法验证与LINGO-1相关的TrkB/p—TrkB以及下游的Akt/p-Akt的表达情况。三、结果：结果发现,在稳定过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto之后,U251/U87MG细胞功能受到了明显抑制,表现为,与对照组细胞相比,U251/U87MG细胞增殖受到了明显抑制,在划痕实验和Transwell实验中,实验组细胞明显比对照组细胞降低了迁移和侵袭能力,实验组中U251/U87MG来源的悬浮干细胞形成克隆的能力也明显减弱,在体裸鼠成瘤实验中,过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto后,U87MG细胞致瘤能力也明显下降。另外,LINGO-1在被PHEN激活后,上述功能也出现了不同程度的抑制。免疫荧光染色和蛋白免疫印迹实验证实,LINGO-1能够抑制TrkB磷酸化,并且影响TrkB-Akt信号通路的表达水平。四、结论：LINGO-1高表达或者激活后能够使U251/U87MG细胞增殖、迁移、侵袭能力受到显著抑制,并且抑制U251/U87MG的干细胞潜能,这种肿瘤抑制作用在在体实验中也进一步得到验证。此种肿瘤抑制功能可能是通过抑制TrkB/p-TrkB-Akt/p-Akt信号通路实验的。本实验共分为七个部分：第一部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达载体构建。第二部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系构建。第三部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系增殖、迁移、侵袭实验。第四部分：LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系成球、克隆形成、裸鼠成瘤实验。第五部分：PHEN激动LINGO-1后增殖、迁移、侵袭实验。第六部分：PHEN激动LINGO-1后细胞系成球、克隆形成、裸鼠成瘤实验。第七部分：PHEN激动LINGO-1后胶质瘤细胞系相关信号水平改变。第一部分、LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达载体构建1、目的：构建携带不同LINGO-1片段过表达载体,提供后续的实验工具。2、方法：我们使用人LINGO-1 FL cDNA (BC011057),经Ncol线性化后,在DNA聚合酶催化下,借助PCR技术,进行目的序列的扩增,利用凝胶电泳以分离不同片段,使用回收试剂盒回收分离出的目的片段,最后产物用EcoRI和NotI双酶切后克隆到PCDH 1-MSCV-EF 1 a-GFP-T2A-Puro (EcoRI/NotI)载体上。检测目的序列有无突变。最后,我们将上述载体质粒转染HEK293FT细胞,利用慢病毒包装系统,包装后含病毒的培养液于无菌台分装,并冻存于-80℃低温冰箱。3、结果：按照分子克隆的原则,经单酶切线性化,PCR扩增,产物胶回收,双酶切,连接载体,测序,慢病毒包装,我们获得了携带LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto准确序列的慢病毒载体。并将包装好的慢病毒分装,冻存于超低温冰箱,以便用于进行后续的构建稳定表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto细胞系的实验。4、结论：经分子克隆和慢病毒包装,我们获得能够感染胶质瘤细胞系并稳定表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto的慢病毒。第二部分、LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系构建1、目的：构建稳定过表达LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto的细胞系。2、方法：为了确定LINGO-1是否具有抗肿瘤作用,以及验证我们所包病毒的表达效率。我们进行了慢病毒感染胶质瘤细胞系实验,即利用携带LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto序列的慢病毒(带有表达绿色荧光蛋白的序列)感染胶质瘤细胞U251和U87MG,使LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto整合到胶质瘤细胞U251和U87MG基因组,并且人为提高U251和U87MG中LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto的表达水平,并进行了蛋白质免疫印迹实验验证LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto表达水平,进而在下一部分实验中检测LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto是否具有抑癌作用。3、结果：携带LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto序列的慢病毒感染U251和U87MG细胞后48h,我们通过荧光显微镜观察,发现95%以上的细胞都可见绿色荧光,蛋白质免疫印迹的检测结果也证明,U251和U87MG细胞LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto表达水平明显增高。4、结论：我们所包装的携带LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto序列的慢病毒能够感染胶质瘤细胞系U251和U87MG,并且能够稳定表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto。第三部分、LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系增殖、迁移、侵袭实验1、目的：为了验证LINGO-1对于胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭等功能的影响,我们运用第二部分所构建的慢病毒感染细胞系进行了一系列功能实验。2、方法：基于上一阶段实验构建好的LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto过表达细胞系。首先细胞经过嘌呤霉素筛选,在荧光显微镜下,100%细胞可见绿色荧光,我们利用WST-1分别检测LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto过表达对U251和U87MG增殖的影响,同时运用划痕实验验证慢病毒感染细胞系24小时迁移速率,Transwell试剂盒被用于检测稳定表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto细胞的侵袭能力变化。最后记录实验数据,使用Graphpad Prism 5.0和Photoshop CS3处理获得的图片和数据。3、结果：与对照组相比,过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto能够显著抑制胶质瘤细胞系U251和U87MG的增殖、迁移能力,过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto能够明显抑制U251的侵袭能力。4、结论：LINGO-1全长和胞外段在胶质瘤细胞系体外试验中能够起到一定的抗肿瘤作用。第四部分、LINGO-1 FL/LINGO-1 Ecto过表达细胞系成球、克隆形成、裸鼠成瘤实验1、目的：进一步验证LINGO-1对于胶质瘤细胞是否具有抗肿瘤形成作用。2、方法：首先我们进行了体外实验,运用上述构建好的LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto过表达细胞系U251和U87MG,将贴壁培养的细胞(含血清培养液)消化成单个细胞、重悬,进行细胞计数后,使用无血清Neurobasal培养液,种植于超低吸附培养皿中,经过8天悬浮培养,查看细胞成球数目和大小。同时我们使用软琼脂克隆形成实验,检测过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto的U251细胞形成克隆的能力。继而,我们进行了在体实验,使用4周龄的裸鼠作为实验小鼠,左右两侧分别种植U87-对照和U87-LINGO-1 FL/LINGO-Ecto细胞,每隔两天测量成瘤大小,经过26天饲养,采集成瘤照片,处死裸鼠,并手术切除肿瘤,肿瘤组织予以固定,行Ki67免疫荧光染色和HE组织染色。3、结果：我们发现在体外实验中,LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto能够明显抑制胶质瘤细胞干细胞潜能和形成克隆的能力。在体实验也证实,过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto后,与对照组成瘤情况相比,两个实验组细胞成瘤能力明显受到抑制,增殖靶标ki67表达水平明显下降,HE结果也体现为组织较为规则,松散,血管形成较少。4、结论：LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto可对胶质瘤细胞细胞产生抗肿瘤形成作用。第五部分、PHEN激动LINGO-1后增殖、迁移、实验1、目的：为了进一步验证LINGO-1被PHEN激活后对于胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭等功能的影响,我们运用构建好的慢病毒感染细胞系进行了一系列功能实验。2、方法：基于第三部分实验,过表达LINGO-1 FL和LINGO-1 Ecto能够显著抑制胶质瘤细胞系的增殖、迁移和侵袭能力,我们猜想,LINGO-1在被PHEN激活后,也可能出现上述功能的改变。首先我们先用10μM浓度PHEN处理U251细胞,并在12h后抽提细胞总蛋白,并运用蛋白质免疫印迹检测LINGO-1激活的效率。然后我们利用WST-1分别检测LINGO-1被PHEN激活后对U251和U87MG增殖的影响,同时运用划痕实验验证PHEN处理过的U251和U87MG细胞系24小时迁移速率,Transwell试剂盒被用于检测LINGO-1激活后细胞的侵袭能力变化。最后记录实验数据,使用Graphpad Prism 5.0和Photoshop CS3处理获得的图片和数据。3、结果：与空白组合对照组相比,LINGO-1能够被PHEN有效激活,并且LINGO-1激活后,U251和U87MG的增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制。4、结论：PHEN能够有效地激活LINGO-1并由此起到一定的抗肿瘤作用。第六部分、PHEN激动LINGO-1后细胞系成球、克隆形成、裸鼠成瘤实验1、目的：同时检验LINGO-1被PHEN激活后对于胶质瘤细胞是否具有抗肿瘤形成作用。2、方法：同样地,我们先进行了体外实验,将U251和U87MG贴壁培养的细胞(含血清培养液)消化成单个细胞、重悬,进行细胞计数后,使用无血清Neurobasal培养液,种植于超低吸附培养皿中,运用101μM浓度的PHEN激活细胞系中的LINGO-1,经过8天悬浮培养,查看细胞成球数目和大小。继而我们使用软琼脂克隆形成实验,检测PHEN激活LINGO-1后是否影响细胞形成克隆的能力。最后,我们进行了在体实验,使用4周龄的裸鼠作为实验小鼠,左右两侧分别种植同样数目U87细胞(2x106／侧),每隔两天测量成瘤大小,然后右侧皮下注射20nmol的PHEN,右侧皮下注射等量的溶剂DMSO,裸鼠经过26天饲养,采集成瘤照片,处死裸鼠,并手术切除肿瘤,肿瘤组织予以固定,行Ki67免疫荧光染色和HE组织染色。3、结果：我们发现在体外实验中,PHEN激活LINGO-1后能够有效抑制胶质瘤细胞干细胞潜能和形成克隆的能力。在体实验也证实,LINGO-1激活后,与对照组成瘤情况相比,实验组细胞成瘤能力明显受到抑制,增殖靶标ki67表达水平明显下降,HE结果也体现为组织较为规则,松散,血管形成较少。4、结论：LINGO-1被PHEN激活后可对胶质瘤细胞细胞产生抗肿瘤形成作用。第七部分、PHEN激动LINGO-1后胶质瘤细胞系相关信号水平改变1、目的：根据前面的实验结果,我们可知,LINGO-1过表达或者被PHEN激活后,对于胶质瘤细胞可起到明显的抗肿瘤作用；而在机制上,LINGO-1是通过哪种信号通路起到抑制肿瘤存活的呢?此问题我们在本阶段实验中进行探究。2、方法：我们利用细胞免疫荧光染色研究,LINGO-1在PHEN处理后,膜上的相关受体蛋白和胞内相关信号分子染色的改变。另一方面,我们利用蛋白质免疫印迹法,验证,经过PHEN激活后,与LINGO-1相关的信号通路分子表达水平的变化。3、结果：实验结果表明,LINGO-1能够抑制TrkB磷酸化水平,并且抑制TrkB下游信号Akt/p-Akt的表达。4、结论：LINGO-1对恶性胶质瘤细胞的抗肿瘤作用有可能是通过改变TrkB/p-TrkB-Akt/p-Akt信号通路表达水平实现。