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背景:临床的长期观察表明角膜损伤(创伤,化学伤,手术损伤等)通常可引起患者发生难治性的视网膜炎,并伴有类似青光眼的不可逆视神经损害,对患眼伤后(或术后)的视力恢复产生不良影响,严重者可因视网膜及视神经损害导致失明。近期有研究表明肿瘤坏死因子家族及白介素家族的细胞因子可能参与了角膜损伤相关视网膜炎症的发生与发展过程,但目前角膜损伤后相关视网膜神经细胞数量丢失及视网膜炎性细胞浸润的具体机制尚不明确,也没有防治此类视网膜损害的有效方法。目的:本研究拟通过建立四种不同的角膜损伤模型,探究角膜损伤过程中免疫细胞参与视网膜炎性反应的作用;证实角膜损伤后视网膜组织中出现巨噬/小胶质细胞及炎性因子的作用机制;观察不同的治疗方案对视网膜炎性反应的抑制及神经保护作用,为临床治疗提供新的思路。方法:1.建立四种不同的角膜急性损伤模型,所有组别均选用C57BL/6小鼠进行NaOH角膜化学烧伤,单根角膜缝线,同种同体穿透性角膜移植术,自同种同体穿透性角膜移植联合晶状体摘除术处理。2.在不同时间点收集角膜及视网膜标本进行qPCR,流式细胞术,TUNEL及激光共聚焦显微镜检测,观察炎性细胞因子的表达情况。3.制备骨髓移植模型,验证视网膜内巨噬/小胶质细胞激活的来源并进一步对免疫细胞进行鉴定;利用Thy1-YFP小鼠检验角膜损伤7天后的视网膜神经细胞生存率。4.分别对四组损伤模型小鼠应用糖皮质激素、TNF-α单克隆抗体及IL-1 β拮抗剂三种免疫抑制药物进行干预治疗,观察不同用药方案对免疫炎性因子的抑制作用。5.利用微流控单细胞测序技术,对视网膜不同来源的免疫细胞表型及免疫治疗效果进行初步分析。结果:1.烧伤后的角膜及视网膜组织中CD45+CD11b+炎性细胞所占比例明显升高(p<0.05),具体分析可见角膜碱烧伤后视网膜细胞可分为CD45hiCD11b+及CD45loCD11b+两群,发现损伤后免疫细胞分别来自血液和视网膜本身,其中CX3CR1+CD45+CD1 1b+MHCII+细胞比例显著增加,证明外周来源的巨噬/小胶质细胞大量浸润并参与炎性反应过程(p<0.01)。碱烧伤后可见TNF-α,IL-1β两种细胞因子的表达在角膜与视网膜两种组织中均明显上调,证明伤后角膜与视网膜同时出现了炎性反应。后续使用CX3CR1GFP/+小鼠骨髓移植模型,通过共聚焦显微镜及流式细胞术的观察验证了碱烧伤后大量血液来源的巨噬/小胶质细胞激活并突破血眼屏障进入视网膜。2.小鼠行穿透性角膜移植术后,角膜及视网膜组织中的CD45+CD11b+炎性细胞比例均明显增多,其中 CX3CR1+CD45+CD1 1b+MHCII+细胞比例显著升高(p<0.01),证实穿透性角膜移植术使视网膜巨噬/小胶质细胞进入了激活状态。qPCR结果显示移植术后的视网膜内TNF-α及IL-1β表达显著上调(p<0.001)。TUNEL实验证实穿透性角膜移植术后存在明显的视网膜细胞凋亡现象,通过CX3CR1GFP/+小鼠骨髓移植模型同样观察到手术后外周血来源的巨噬/神经小胶质细胞激活并突破血眼屏障进入视网膜,共聚焦显微镜证实移植术后的Thy-YFP小鼠视网膜神经细胞的数量明显减少(p<0.01)。3.三种角膜手术模型的qPCR结果显示,TNF-α,IL-1β,IL-6及相应受体的表达均显著升高,穿透性角膜移植术联合晶状体摘除术组的炎性因子表达均上调至对照组的135倍以上,直接证明三种角膜手术模型均可诱发视网膜炎性反应的假设。单根角膜缝线组的免疫治疗研究表明糖皮质激素对TNF-α的抑制作用明显弱于单用英夫利昔单抗或阿那白滞素以及联合用药(p<0.001);穿透性角膜移植术组的结果显示四种治疗方案均有效果,但是特异性免疫抑制剂的作用仍优于糖皮质激素(p<0.001);穿透性角膜移植加晶状体摘除术的损伤程度远超前两种手术模型,特异性免疫抑制剂联合治疗组下调炎性因子的效果优于单种药物应用或糖皮质激素(p<0.001)。另外,联合治疗组在穿透性角膜移植术后24小时显著减轻视网膜细胞凋亡,减少外周血来源的免疫细胞进入视网膜参与炎性反应;术后7天联合治疗组仍能维持理想的视网膜神经细胞数量,炎性细胞比例与正常对照组无明显差异,效果优于单用免疫抑制剂或糖皮质激素(p<0.05)。4.单细胞测序结果:角膜碱烧伤模型建立6周后,发现急性期特异性免疫抑制剂治疗组小鼠视网膜小胶质细胞/巨噬细胞的转录组信息与正常组小鼠类似;角膜碱烧伤模型建立2年后,发现未治疗组小鼠视网膜小胶质细胞和巨噬细胞的转录组都明显偏离静息小胶质细胞轴,特异性免疫抑制剂治疗组小鼠视网膜内的小胶质细胞/巨噬细胞仍能保持相对静息的状态,其基因组也没有发生剧烈变化的迹象。结论:1.本研究建立四种角膜损伤模型并进行对比,创新性提出角膜手术损伤诱发视网膜炎性反应的新观点;2.发现外周巨噬细胞浸润并突破血眼屏障与小胶质细胞共同参与视网膜组织的炎性反应,穿透性角膜移植术联合晶状体摘除术处理组的炎性反应表现最为严重,说明角膜手术损伤程度与炎性因子的表达正相关,为阐明角膜损伤相关视网膜病变的发生机制提供理论基础;3.为角膜损伤相关的视网膜炎性反应提出新的临床治疗方案,提示在损伤急性期特异性免疫抑制剂可减轻视网膜炎性因子的表达,证实阻断免疫细胞激活可有效抑制视网膜组织中的巨噬/小胶质细胞数量的增长,防止视网膜细胞损伤。4.单细胞mRNA测序结果表明角膜损伤急性期的免疫治疗可防止视网膜巨噬/小胶质细胞的基因表达变化,对角膜损伤继发视网膜炎性损害的临床用药具有一定的指导意义。