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目的:慢性肾脏病(Chronic Kidney disease,CKD)的发病率逐年升高,目前已成为一个世界性的问题,研究表明心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)是CKD患者死亡的首位原因,其中血管钙化是心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)发病的独立危险因素。血管中膜钙化是CKD患者血管钙化的主要特点。血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)是血管中膜的重要组成部分,研究发现,镁可以抑制血管中膜钙化,但其具体机制及其复杂,目前尚不明确。本研究主要探讨高镁对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响及可能机制。方法:1大鼠VSMCs的原代培养及实验分组贴壁法原代细胞培养,3~4代细胞供实验用,将细胞随机分为A、正常对照组;B、高磷组(10mmol/Lβ-GP);C、高镁组(10mmol/Lβ-GP+3mmol/L Mg SO4)D、镁通道抑制剂(2-APB)干预组(10mmol/Lβ-GP+3mmol/L Mg SO4+10-4mol/L 2-APB)。各组VSMCs培养7天。2血管环的制备及分组1只SD雄性大鼠220-250 g,取其胸主动脉,去除内、外膜后,并将血管切成约2mm-3mm长的血管环进行培养,血管环被随机分为4组:a、正常对照组;b、高磷组;c、高镁组:d、镁通道抑制剂干预组。各组培养基同细胞培养。各组血管环培养7天。3培养7天后测定各组VSMCs和血管环的钙化水平各组VSMCs的钙化染色应用茜素红(Alizarin red stain)法,血管化的钙化染色应用Von Kossa染色法;应用邻甲酚酞络合酮比色法测定各组VSMCs和血管环的钙含量。4培养7天后各组VSMCs的碱性磷酸酶(ALP)活性测定各组细胞培养7天后弃上清,应用PBS洗3次,加入0.1%Triton X-100置于4℃环境中过夜,并依据ALP活性试剂盒说明测定其活性,每组实验均重复3次。5反转录-PCR、Western Blot检测各组VSMCs中RUNX2基因及蛋白的表达应用反转录-PCR方法检测培养7天后各组VSMCs RUNX2基因的表达。应用Western Blot方法检测各组VSMCs培养7天后RUNX2蛋白的表达。6免疫组织化学法检测血管环Runx2表达应用免疫组织化学方法检测各组血管环培养7天后RUNX2的表达。7反转录-PCR、Western Blot检测各组VSMCs中目的基因及蛋白的表达应用反转录-PCR方法检测培养7天后各组VSMCs LTCCα1c、β3基因的表达。应用Western Blot检测培养7天后各组VSMCs LTCCα1c、β3蛋白的表达。8培养7天后各组VSMCs内钙离子浓度测定培养7天后各组VSMCs内钙离子浓度应用荧光探针Fluo-3/AM方法检测。9统计学方法应用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理,符合正态分布的计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,多个样本均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较用S-N-K检验(Student-Newman-Keuls,SNK)。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1高镁抑制高磷诱导的VSMCs和血管环钙化茜素红染色结果示,与正常对照组相比,高磷组可见大量橘红色钙盐沉积;而与高磷组相比,高镁组VSMCs钙盐沉积显著减少,镁通道抑制剂干预组VSMCs钙盐沉积较镁干预组明显增加。与茜素红染色相一致,钙含量测定结果显示高磷诱导的钙盐沉积可被镁干预组明显降低(P<0.05),而2-APB可抑制这种作用(P<0.05)。各组血管环Von Kossa染色结果示:与正常对照组相比,高磷组血管环中膜可见大量棕黑色颗粒沉积,高镁可明显减少棕黑色颗粒的沉积。钙含量测定结果与血管环Von Kossa染色结果一致示:与正常对照组相比,高磷组血管环的钙含量明显升高(P<0.05),而高镁组血管环钙含量明显低于高磷组(P<0.05)。2高镁抑制高磷诱导的VSMCs ALP活性各组VSMCs ALP活性测定结果示:高磷组及镁通道抑制剂干预组ALP活性明显高于高镁组(P<0.05)。3高镁抑制高磷诱导的VSMCs RUNX2的表达情况反转录-PCR和Western Blot结果显示,各组VSMCs培养7天后,较高镁组RUNX2表达水平相比,高磷组及镁通道抑制剂干预组明显增加(P<0.05)。4高镁抑制高磷诱导的血管环RUNX2的表达各组血管环培养给予不同干预7天后,免疫组织化学检测结果示,高磷组血管细胞质内外可见棕黄色物质沉积,明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);与高磷组相比,高镁组血管细胞质内外棕黄色物质变淡,着色区域面积明显减少,Runx2表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),与高镁组相比,镁通道抑制剂干预组血管细胞质内外棕黄色物质增加,差异有统计学意义(P<0.05)。5高镁抑制高磷诱导的VSMCs LTCCα1c、β3的表达反转录-PCR和Western Blot结果示,各组VSMCs培养7天后,高镁组LTCCα1c、β3的表达水平明显低于高磷组及镁通道抑制剂干预组(P<0.05)。6高镁抑制高磷诱导的VSMCs胞外钙离子内流效应各组VSMCs Fluo-3/AM荧光强度和荧光显色结果显示,与正常对照组相比,高磷组VSMCs荧光强度明显增加(P<0.05);与高磷组相比,高镁组胞内荧光强度下降(P<0.05)。结论:1本研究结果显示高镁可抑制高磷诱导的VSMCs钙化。2其可能机制之一是高镁通过抑制VSMCs LTCCα1C、β3亚基的表达、阻滞钙离子内流、降低Runx2的表达,抑制VSMCs发生表型转化,进而抑制了高磷诱导的钙化过程的发生。