蛹虫草多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究

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蛹虫草(Cordyceps militaris L.Link)多糖具有抗氧化、降血糖、免疫调节等多种药理作用,在医学、保健品、食品、药物载体等领域有良好的应用前景。为了寻找高活性的蛹虫草多糖并进行构效关系的研究,我们对蛹虫草子实体中的多糖进行了比较系统的提取、分离纯化、结构鉴定及抗氧化研究。主要结果如下:  1.蛹虫草子实体多糖的提取工艺  分别采用热水和碱液提取蛹虫草子实体多糖。结果表明,蛹虫草子实体水提多糖(W-CBP)适宜提取条件为:(1)煎煮法:料液比1:40(W:V),提取3 h,提取3次;(2)热回流法:料液比为1:20(W:V)、浸提温度80℃、浸提1 h,提取2次。  蛹虫草子实体碱提多糖(A-CBP)适宜提取条件为:料液比1:8(W:V),NaOH浓度0.7 mol/L,浸提时间0.5 h,提取3次。  2.蛹虫草子实体多糖的纯化及其纯度鉴定  W-CBP和A-CBP经过乙醇沉淀、丙酮和乙醚脱脂、Sevag法脱蛋白、透析、乙醇分级沉淀以及葡聚糖凝胶柱层析进行分离纯化。水提多糖50%乙醇醇析粗多糖(W-CBP50)依次进行Sephadex G-100和Sephadex G-200的柱层析,得到多糖纯度高而蛋白含量低的纯化水提多糖组分Ⅰ(W-CBP50Ⅱ);水提多糖80%乙醇醇析粗多糖(W-CBP80)、碱提水溶多糖50%乙醇醇析粗多糖(A-WSCBP50)、碱提水不溶多糖50%乙醇醇析粗多糖(A-WISCBP50)分别进行Sephadex G-100柱层析,得到多糖纯度高而蛋白含量低的纯化水提多糖组分Ⅱ(W-CBP80Ⅰ)、纯化碱提水溶多糖组分Ⅰ(A-WSCBP50Ⅰ)、纯化碱提水不溶多糖组分Ⅰ(A-WISCBP50Ⅰ)。经多糖PAGE实验、凝胶层析、紫外-可见光谱分析及凝胶渗透色谱(GPC)鉴定其纯度,主要成分纯度均较高。  3.蛹虫草子实体多糖的理化特性及结构分析  通过GPC、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、红外光谱、核磁共振等分析方法研究了蛹虫草子实体纯化多糖的理化性质及化学结构。  (1)W-CBP50Ⅱ的理化特性及结构分析  GPC法测得W-CBP50Ⅱ中主要组分(相对质量分数为93.14%的多糖)重均分子量为Mw=8.97。kD,数均分子量为Mn=8.47 kD,分子量分布宽度:Mw/Mn=1.06,Mw/Mn的比例接近1,表明该多糖的分子量分布较均一。  GC-MS分析结果表明,W-CBP50Ⅱ的单糖组分主要为葡萄糖(47.505%)、甘露糖(34.281%)和半乳糖(10.800%),含少量阿拉伯糖(4.853%),同时含微量的核糖(0.809%)、鼠李糖(0.862%)及木糖(0.891%);  IR、1H NMR分析结果表明,W-CBP50Ⅱ组成单糖主要是α-D-吡喃型,糖苷键为α-型。  (2)W-CBP80Ⅰ的理化特性及结构分析  GPC法测得W-CBP80Ⅰ中主要组分(相对质量分数为96.73%的多糖)重均分子量为Mw=8.93 kD,数均分子量为Mn=8.26 kD,Mw/Mn=1.08,比例接近1,表明该多糖的分子量分布较均一。  W-CBP80Ⅰ的单糖组分主要为葡萄糖(28.801%)、甘露糖(31.178%)和半乳糖(29.576%),少量阿拉伯糖(5.899%),亦含微量的核糖(0.994%)、鼠李糖(1.788%)及木糖(1.764%)。  IR、1H NMR、13C NMR分析结果表明,W-CBP80Ⅰ组成单糖主要是α-D-吡喃型,糖苷键为α-型。  (3)A-WSCBP50Ⅰ的理化特性及结构分析  GPC法测得A-WSCBP50Ⅰ中主要组分(相对质量分数为98.94%的多糖)重均分子量为Mw=8.17 kD,数均分子量为Mn=7.59 kD,分子量分布宽度为:Mw/Mn=1.08,比例接近1,说明该多糖的分子量分布较均一。  A-WSCBP50Ⅰ的单糖组分主要为葡萄糖(38.665%)、甘露糖(27.219%)和阿拉伯糖(21.956%)、少量半乳糖(6.900%)、核糖(3.127%)及微量的鼠李糖(1.381%)及木糖(0.753%)。  IR、GC-MS、1H NMR分析结果表明,A-WSCBP50Ⅰ组成单糖主要是α-D-吡喃型,糖苷键为α-型。  (4)A-WISCBP50Ⅰ的理化特性及结构分析  A-WISCBP50Ⅰ主要由葡萄糖(69.057%)和甘露糖(27.799%)组成,亦含微量的半乳糖(0.240%)、阿拉伯糖(1.810%)、核糖(0.427%)、鼠李糖(0.385%)及木糖(0.282%)。  IR、1H NMR分析结果表明,A-WISCBP50Ⅰ组成单糖是α-D-吡喃型,也可能有β-D-吡喃型,含有α-型糖苷键,可能也有β-型糖苷键。  4.蛹虫草子实体多糖的抗氧化作用  蛹虫草子实体多糖W-CBP50、W-CBP50Ⅰ、W-CBP50Ⅱ、W-CBP80、W-CBP80Ⅰ、A-WSCBP、A-WSCBP50Ⅰ、A-WISCBP在体外均具有抗氧化活性。对DPPH·的清除能力强弱为:W-CBP50Ⅰ>W-CBP50>W-CBP50Ⅱ;W-CBP80Ⅰ>W-CBP80;A-WSCBP>A-WSCBP50Ⅰ。对·OH的清除能力强弱为:W-CBP50Ⅰ>W-CBP50;W-CBP80Ⅰ>W-CBP80。W-CBP50、W-CBP50Ⅰ、W-CBP80Ⅰ、A-WSCBP、A-WISCBP等多糖能够有效清除核黄素产生的O2-。对O2-·自由基的清除能力强弱为:W-CBP50Ⅰ>W-CBP50>W-CBP80Ⅰ。W-CBP80、W-CBP80Ⅰ、A-WSCBP、A-WSCBP50Ⅰ、A-WISCBP抗氧化活性随多糖浓度增加而增强。W-CBP50、W-CBP50Ⅰ抗氧化活性在一定多糖浓度范围内随浓度增加而增强,之后多糖浓度再增加抗氧化活性下降。A-WSCBP对O2-·的清除作用有相同趋势。
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