兰花芽分化的分子机理和相关功能基因克隆

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兰花(Cymbidium)是中国传统名花,具有重要的观赏、文化和经济价值。不同种兰花组培快繁特性不同、效率差异明显。因此,深入研究兰花组培快繁特性,阐明中间繁殖体芽分化的分子机制和不同兰花芽分化能力差异的遗传机制,对推动我国兰花研究和产业发展具有十分重要的现实意义。本文研究了不同基因型兰花中间繁殖体的分化特性,筛选兰花组培快繁阶段稳定表达的内参基因,对‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’芽分化过程中内源激素及转录组进行测定和比较分析,找出与芽分化相关的候选基因,并对其进行克隆和功能分析。主要研究结果如下:1.在无外源植物激素和黑暗条件下培养,纹瓣兰、‘大凤兰’、‘小凤兰’、‘国凤兰’和‘企剑白墨墨兰’的中间繁殖体只增殖,不分化;但在无外源植物激素和有光条件下培养,纹瓣兰、‘大凤兰’、‘小凤兰’和‘国凤兰’中间繁殖体均能分化形成芽和根,其芽分化率分别为100%、100%、99.17%和95.29%,根分化率分别为98.67%、10.59%、63.33%和87.50%,而‘企剑白墨墨兰’既不能进行芽分化也不能进行根分化。在黑暗下培养,培养基中添加6-BA或/和NAA,‘小凤兰’的根状茎不能分化出芽,表明,光诱导‘小凤兰’芽分化的作用不能被6-BA和NAA取代;在含有1 mg/L NAA培养基上,小凤兰根状茎能分化出根,表明光不是‘小凤兰’根分化所必需的。2.利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对18S ribosomal RNA(18S)、26S ribosomal RNA(26S)、Actin(ACT)、Elongation factor 1 alpha(EF1α)、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Photosystem I P700apoprotein B(Psa B)、RNA polymerase B(Rpo B)、Ribosomal protein S3(Rps3)、Ribosomal protein S19(Rps19)和beta-tubulin(TUB)10个内参基因进行了表达稳定性评估。结果表明,Rps3、GAPDH和ACT适合作为纹瓣兰、‘大凤兰’、‘小凤兰’、‘国凤兰’和‘企剑白墨墨兰’组织培养增殖和分化阶段的内参基因。3.将在无外源植物激素和黑暗条件下培养的‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’根状茎转入光下培养,‘小凤兰’根状茎在见光后10天开始芽分化,20天开始根分化,25天时叶片已展开,30天时根明显伸长,而‘企剑白墨墨兰’根状茎缓慢增殖不分化。对‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’根状茎在见光后0小时、1天、5天、10天、15天和20天的内源激素含量进行测定。结果发现,所测的生长素、玉米素、异戊烯腺嘌呤、双氢玉米素、油菜素内酯、茉莉酸甲酯、脱落酸和GA3在两个品种之间都存在着显著差异。‘小凤兰’中除玉米素含量低于‘企剑白墨墨兰’外,其余7种激素含量均高于‘企剑白墨墨兰’。‘小凤兰’中生长素、异戊烯腺嘌呤和玉米素的含量在芽分化时达到最高值。4.利用Illumina Hiseq X技术对‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’根状茎见光后0小时、1天、5天、10天、15天和20天的材料进行转录组测序,共获得了158,352个unigene,KEGG分析结果显示,这些基因主要富集在碳代谢、氨基酸生物合成、核糖体、淀粉和蔗糖代谢、剪接体、内质网蛋白的加工、嘌呤代谢、RNA转运和植物激素信号转导等代谢途径中。差异基因分析结果表明,‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’根状茎见光后0小时、1天、5天、10天、15天和20天差异表达基因数分别为8718,8940,10435,8967,12598和9890个,这些差异表达基因主要富集在剪接体、信使RNA监视通路和氨酰t RNA生物合成通路中。‘小凤兰’芽分化不同阶段的差异表达基因数分别为969,541,151,150和212个,‘企剑白墨墨兰’差异表达基因数分别为1091,1207,111,98和44个,这些差异表达基因主要显著富集在光合作用、光合作用-天线蛋白、植物昼夜节律、卟啉和叶绿素代谢、光合生物中碳的固定和类黄酮的生物合成代谢通路中。5.通过q RT-PCR分析,筛选出8个芽分化相关的候选基因,分别为HY5、YUC8、TIR1、ARF11、GH3.1、GH3.5、LOG8和AHK。6.通过SMARTer RACE 5’/3’技术获得‘小凤兰’YUCCA6基因的全长c DNA为2058 bp,其中5’非编译区(5’UTR)为259 bp,编码区(CDS)为1221 bp,3’非编译区(3’UTR)为575 bp;GH3.8M基因的全长c DNA为2028 bp,其中5’UTR为57 bp,CDS为1803 bp,3’UTR为165 bp;AHK4基因的全长c DNA为4419 bp,其中5’UTR为996 bp,CDS为2865 bp,3’UTR为558 bp;CKX9基因的全长c DNA为2248 bp,其中5’UTR为77 bp,CDS为1560 bp,3’UTR为608bp。7.通过PCR和同源克隆技术获得了‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’中AHK4、YUCCA6、GH3.8M和CKX9的ORF及对应的基因组序列。序列分析可知,‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’中四个基因的ORF序列均完全一致,基因组序列也完全一致。‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’中,YUCCA6的基因组包含4个外显子和3个内含子,长度为3351 bp;GH3.8M的基因组由3个外显子和2个内含子组成,长度为2597 bp;AHK4的基因组包含了11个外显子和10个内含子,长度为8067 bp;CKX9的基因组DNA转录时存在可变剪切,在‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’中均存在两种结构形式,一种为包含4个外显子和3个内含子,总长度为1831 bp,另一种为第三个内含子不被剪切而变为外显子。内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则。8.构建了AHK4、YUCCA6、GH3.8M和CKX9四个基因的过表达和干涉载体,通过农杆菌介导的方法转化‘小凤兰’和‘企剑白墨墨兰’根状茎,未获得转基因植株。通过上述研究,明确了光在兰花根状茎分化中的作用以及根状茎芽分化过程中内源激素和转录组的变化,初步确定了与兰花芽分化相关的基因,获得了AHK4、YUCCA6、GH3.8M和CKX9基因序列,为进一步研究兰花芽分化基因的功能、不同兰花组培快繁特性的遗传基础以及开展兰花组培快繁特性的分子育种奠定了基础。
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