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背景与目的:乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,且发病率近年有递增趋势。多药耐药(multidrug resistance,MDR)和肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的产生是影响乳腺癌预后的两大重要因素。乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)是新近发现的ABC(ATP binding cassette)家族的膜转运蛋白,已被证实为CSCs标记物之一。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移的主要原因,近年来被证实与CSCs和BCRP介导的MDR密切相关。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是新近确立的一种肿瘤相关抗原,可诱导EMT产生。本课题旨在研究EpCAM是否通过诱导EMT促进BCRP介导的乳腺癌的MDR及干性,进而影响乳腺癌的预后。方法:1.米托蒽醌(mitoxantrone,MX;0.04、0.08、0.16 nM)处理乳腺癌MCF-7细胞1周,用Western blot法测BCRP、CSCs标记物、EpCAM、EMT相关蛋白表达水平变化。2.Western blot法测定乳腺癌敏感株MCF-7、耐药株MCF-7/MX细胞中BCRP、CSCs标记物、EpCAM及EMT相关蛋白表达水平。3.TGF-β1(10 ng/ml)和/或TNF-α(10 ng/ml)处理MCF-7细胞6天,Western blot法测EMT相关蛋白、BCRP、EpCAM及CSCs标记物的表达水平。4.设计针对EpCAM的siRNA,靶向干扰MCF-7/MX细胞中EpCAM表达,用Real-time PCR和Western blot法鉴定EpCAM敲低程度后,用MCF-7/MX、阴性对照株MCF-7/MX/siNC、干扰效率大于50%的细胞株MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2进行后续实验。5.Western blot法测各组细胞BCRP、PCNA、CSCs标记物及EMT相关蛋白的表达。6.CCK8法测各组细胞对MX的敏感性。7.Transwell法实验测各组细胞的迁移和侵袭能力。8.Western blot法测定MCF-7和MCF-7/MX细胞Wnt通路相关蛋白的表达差异;Wnt通路抑制剂ICG-001(5μM and 10μM)处理MCF-7/MX细胞24 h,Western blot法测定其Wnt通路相关蛋白、EpCAM及CSCs标记物的表达变化。结果:1.EpCAM表达与BCRP介导的乳腺癌细胞的MDR和干性相关。用MX(0.04、0.08、0.16 nM)处理MCF-7细胞1周后,BCRP及CSCs标记物表达升高,EpCAM蛋白表达同步升高;与乳腺癌敏感株MCF-7细胞相比,MCF-7/MX细胞耐药性及干性增强,EpCAM表达明显增多(P<0.001)。2.siRNA法成功敲低EpCAM。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞EpCAM变化不明显(P>0.05),干扰组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞中EpCAM表达下调大于50%(P<0.001)。3.敲低EpCAM可逆转BCRP介导MCF-7/MX细胞的MDR。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞BCRP蛋白表达和对MX的敏感性变化不明显(P>0.05),敲低组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞中BCRP表达明显减少(P<0.001),且对MX的耐药性降低(P<0.001)。4.敲低EpCAM可致MCF-7/MX细胞干性减弱。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞PCNA和CSCs标记物表达变化不明显(P>0.05),EpCAM敲低组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞中上述蛋白表达明显减少(P<0.001)。5.EpCAM与乳腺癌EMT密切相关,且后者促进BCRP介导的乳腺癌MDR和干性。用TGF-β1(10 ng/ml)和/或TNF-α(10 ng/ml)处理MCF-7细胞6天诱导其发生EMT,EpCAM表达明显上调(P<0.05,P<0.01);TGF-β1组BCRP及干细胞标记物表达水平变化不明显(P>0.05),TNF-α和TNF-α+TGF-β1组BCRP及CSCs标记物表达水平均明显升高(P<0.001,P<0.0001)。6.敲低EpCAM可减弱MCF-7/MX细胞的迁移和侵袭能力,逆转其EMT发生。与MCF-7/MX细胞相比,阴性对照MCF-7/MX/siNC细胞迁移和侵袭能力及EMT相关蛋白表达变化不明显(P>0.05),EpCAM敲低组MCF-7/MX/siEpCAM-RNA1及-RNA2细胞的迁移和侵袭能力降低(P<0.01,P<0.001),E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.01,P<0.001),N-cadherin及vimentin蛋白表达水平降低(P<0.01,P<0.001)。7.敲低EpCAM可逆转EMT。siRNA法敲低本课题组构建的呈EMT表型的细胞株MCF-7/siCK18-3C中的EpCAM,与空白组MCF-7/siCK18-3C细胞相比,阴性对照组MCF-7/siCK18-3C/siNC细胞中EMT相关蛋白表达水平变化不明显(P>0.05);EpCAM敲低组MCF-7/siCK18-3C/siEpCAM中EMT相关蛋白E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.001),N-cadherin表达水平降低(P<0.001)。8.EpCAM促进乳腺癌耐药和干性可能与Wnt/β-catenin通路有关。与MCF-7相比,MCF-7/MX细胞Wnt/β-catenin相关蛋白表达升高;用Wnt信号通路抑制剂ICG-001处理MCF-7/MX细胞,β-catenin表达被明显抑制,同时EpCAM及CSCs标记物表达减少(P<0.05)。结论:1.EpCAM促进BCRP介导的乳腺癌细胞的耐药和干性。2.EpCAM可能通过诱导EMT促进BCRP介导的乳腺癌细胞的耐药及干性。3.EpCAM可能通过Wnt/β-catenin信号通路增强乳腺癌细胞的耐药和干性。