论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的猪的一种急性高度接触性传染病。该病广泛分布于世界各地，给畜牧业造成严重危害。结合TGEV的致病特点、免疫特性探索开发安全、廉价、效力稳定的新型疫苗对预防该病具有重要的意义。乳酸菌被公认为安全级(generallyrecognizedassafe，GRAS)微生物，是作为黏膜免疫的活载体的理想选择。近二十年来，对于表达外源抗原的乳酸菌作为口服免疫活载体疫苗的研究已经受到了广泛的重视并取得了一定进展。
本研究以含有猪传染性胃肠炎病毒N基因的重组质粒pHN为模板，利用Oligo6.0软件设计并合成2对TGEVN基因引物，通过PCR分别扩增出两端含有NcoI、SacI酶切位点N基因片段和含有BamHI、XholI酶切位点的N基因片段。将含有NcoI、SacI酶切位点N基因片段克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒pMD18-T-N。对pMD18-T-N进行鉴定后，将粘性末端的N基因与乳酸乳球菌表达载体pNZ8048连接，连接产物电转化至乳酸乳球菌NZ9000中，得到含有重组表达载体pNZ8048-N的乳酸乳球菌pNZ8048-N/NZ9000。用1ng/ml的乳酸链球菌肽nisin诱导重组菌后，SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物，得到与预计大小相符的43kD重组蛋白，说明N基因在乳酸乳球菌表达系统中获得表达。光密度扫描对表达产物进行初步定量，表明重组蛋白约为菌体总蛋白的8.3％。将含有BamHI、XholI酶切位点N基因片段克隆到pGEM-T载体上，构建了重组质粒pGEM-T-N。对pGEM-T-N进行鉴定后，将粘性末端的N基因与干酪乳杆菌表达载体pPG611.1连接，连接产物转化入大肠杆菌JM109中，获得重组表达载体pPG611.1-N。对pPG611.1-N进行鉴定后，将其电转化至干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中，得到含有pPG611.1-N表达载体的干酪乳杆菌pPG611.1-N/Lactobacilluscasei393。用1％核糖和1％乳糖诱导重组干酪乳杆菌后，SDS-PAGE分析表达产物，结果显示1％核糖诱导的重组干酪乳杆菌产生预计大小相符的49kD的融合蛋白，说明N基因在干酪乳杆菌表达系统中获得表达。光密度扫描对表达产物进行初步定量，表明重组蛋白约为菌体总蛋白的2.7％。将重组乳酸乳球菌悬液和菌体裂解物分别通过口服途径和腹腔注射途径免疫小鼠，间接ELISA方法检测小鼠粪便中IgA抗体和血清中IgG抗体。检测结果表明免疫小鼠产生了针对TGEVN蛋白的特异性局部免疫应答和全身免疫应答。本研究为探索开发预防猪传染性胃肠炎的有效口服疫苗提供物质依据，也可以为猪传染性胃肠炎病毒N基因的作用和功能的研究提供参考。