论文部分内容阅读
锰过氧化物酶(MnP)是白腐真菌分泌的一种木质素降解酶,MnP对各种芳香族化合物具有独特的氧化降解能力,在纸浆的生物漂白、有机污染物的降解、染料的脱色、褐煤的生物降解、农业废弃物的处理等方面得到了较多的研究与应用。本实验选择稻壳作为基质,利用本实验室保存的白腐真菌——裂褶菌F17(Schizophyllum sp. F17)固态发酵产锰过氧化物酶(MnP),并对MnP进行分离纯化;构建了MnP对偶氮染料金橙-G的脱色体系;初步探索了mnp基因克隆的实验方法和条件。主要结果如下: 1、实验通过超滤浓缩、DEAE-纤维素DE52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,分离纯化得到电泳纯的锰过氧化物酶。最终锰过氧化物酶的比活力为1.35,活力回收率为3.5％。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，MnP只显示一条带,达到电泳纯。锰过氧化物酶的相对分子量为49.2kDa,等电点为3.7。以DMP作为底物,测得锰过氧化物酶的最适反应pH为5;以愈创木酚为底物时,测得锰过氧化物酶的最适pH为4.5;以Mn2+为底物时,测得锰过氧化物酶的最适pH为4.5。锰过氧化物酶的最适反应温度为35℃。 2、分别用不同的pH值、Mn2+浓度、H2O2浓度进行偶氮染料金橙-G的脱色实验,得到pH为3、Mn2+浓度为0.1mmol/L、H2O2浓度为0.2mmol/L时的最佳脱色体系。在此体系下,连续脱色6h,最终脱色率可达到57％。且实验表明,在pH值为3-5时,脱色率均不低于20％;Mn2+浓度为0.08-0.5 mmol/L范围内,脱色率保持在30％以上;当H2O2浓度在0.02-0.4mmol/L范围内,脱色率的变化不明显。 3、分别使用蜗牛酶法、CTAB法、蛋白酶K法和SDS法提取裂褶菌F17,通过比较提取的基因组纯度、浓度及操作成本、步骤等,得到,蜗牛酶法提取的基因组纯度和浓度都比较高,且操作最为简便。使用锰过氧化物酶的简并引物,以裂褶菌F17基因组为模版进行PCR,通过反复试验,得到稳定的PCR反应体系为:模版1.5ul,10×PCR buffer2.5ul,25mmol/L MgCl22.5ul,100mmol/L dNTPs1ul,上游引物1ul,下游引物1ul,Taq酶0.5ul,灭菌水15ul,反应条件为:94℃预变性4min,94℃40s,54℃50s,72℃60s循环30次,最后在72℃延伸1min。在此条件下进行PCR,得到600bp左右的条带。经过DNA片段的回收纯化和T载体连接、克隆,片段碱基序列已被测出。