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背景和目的胆管癌是一种起源于胆管上皮细胞高度恶性的肿瘤。缺乏有效的治疗药物是其预后较差的重要原因之一。因此探索新的抗胆管癌的药物就成为临床亟待解决的问题。鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,Sphk)是调控鞘磷脂代谢通路的激酶,有两种异构体Sphk1和Sphk2。Sphk可以将具有促凋亡作用的鞘氨醇(Sphingosine,Sph)代谢为具有促进增殖作用的1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。研究发现Sphk在很多肿瘤中过表达,并且具有促进肿瘤发生发展的作用,是肿瘤治疗的新靶点。最近的一项研究发现相较于Sphk1,Sphk2在胆管癌细胞中的表达较高,同时S1P(很可能来自于Sphk2)可以促进胆管癌细胞的增殖和迁移,因此S1P及Sphk2可能是胆管癌治疗的潜在靶点。ABC294640是一种新型的Sphk2小分子抑制剂,具有特异性强、口服吸收性好、副作用小等优点,已在较多的体内和体外试验中显示出较强的抗肿瘤作用,并已经进入Ⅱ期临床试验。前期研究显示ABC294640可通过诱导凋亡和自噬导致细胞死亡,但目前有较多证据显示抗肿瘤药物诱导的自噬亦可以促进细胞的存活并导致耐药的发生。在肝癌及肾癌细胞中,ABC294640与索拉非尼还具有累加和协同抗肿瘤作用,而索拉非尼同时可用于胆管癌的治疗。目前为止关于Sphk2在胆管癌中作用及ABC294640是否具有抗胆管癌的效果还不清楚。因此,本研究拟检测Sphk2在胆管癌细胞中的表达情况并探讨Sphk2抑制剂ABC294640对胆管癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响,同时研究自噬抑制剂是否可以增强ABC294640的抗胆管癌疗效,并探讨ABC294640是否与索拉非尼具有协同抗胆管癌的作用。方法使用 Real-time PCR 检测人胆管癌细胞株 WITT、HuCCTl、EGI-1、OZ、HuH28、LIV27及人永生化正常胆管上皮细胞H69中Sphk2 mRNA的表达水平。采用Sphk2特异性的小分子抑制剂ABC294640处理胆管癌细胞后,通过BrdU ELISA增殖检测试剂盒和平板克隆形成试验检测细胞增殖能力的变化,采用DAPI染色、Annexin V-FITC-PI凋亡检测试剂盒检测凋亡,Western Blotting检测凋亡相关标记物 PARP,Caspase 3,Caspase 8 和 Caspase 9 蛋白水平的变化,及 ABC294640对STAT3磷酸化水平的影响。用ABC294640处理胆管癌细胞后,使用Western Blotting和免疫荧光检测自噬特异性蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表达和分布情况,电镜检测自噬体和自噬溶酶体的形成情况,使用溶酶体抑制剂巴弗洛霉素和氯喹与ABC294640联合处理胆管癌细胞后Western Blotting检测LC3-Ⅱ蛋白表达的变化,用BrdU ELISA、平板克隆形成试验和DAPI染色检测联合使用自噬抑制剂和ABC294640对胆管癌细胞增殖及凋亡的影响。索拉非尼与ABC294640以不同但固定比例的浓度联合处理胆管癌细胞(HuCCT和WITT)后,使用BrdU ELISA检测增殖,通过CompuSyn软件计算索拉非尼与ABC294640的协同指数(CI),用Western Blotting检测ABC294640与索拉非尼联合使用后对细胞中STAT3磷酸化的影响。结果Sphk2 mRNA 在六种胆管癌细胞株(WITT、HuCCTl、EGI-1、OZ、HuH28和LIV27)中的表达均显著高于正常胆管上皮细胞株H69(P<0.05)。BrdU ELISA试验显示Sphk2特异性抑制剂ABC294640能浓度依赖性的抑制胆管癌细胞的增殖,处理72 h后半数抑制浓度(IC50)在36.3-48.6μ 之间。平板克隆形成试验显示ABC294640能显著抑制胆管癌细胞HuCCTl和EGI-1的克隆形成能力,处理一周后IC50分别为24.4 μM和24.6 μM。同时ABC294640能浓度依赖性的激活Caspase通路并促进细胞凋亡的发生。使用Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK可以抑制ABC294640诱导的凋亡。ABC294640处理后胆管癌细胞内的STAT3磷酸化明显受到抑制。此外,ABC294640可以明显诱导自噬的形成。自噬抑制剂巴弗洛霉素及氯喹与ABC294640联合使用后可以显著增强ABC294640对胆管癌细胞增殖及克隆形成能力的抑制(P<0.05),显著提高ABC294640诱导的细胞凋亡(P<0.05)。ABC294640与索拉非尼具有协同抑制胆管癌细胞(WITT和HuCCTl)的增殖能力,协同指数CI<1。ABC294640与索拉非尼共同处理胆管癌细胞后对磷酸化STAT3的抑制较单独使用ABC294640或索拉非尼更明显。结论Sphk2 mRNA过表达于胆管癌细胞中,Sphk2的抑制剂ABC294640可以抑制胆管癌细胞增殖,促进胆管癌细胞凋亡,同时可以抑制STAT3的活化。ABC294640可以诱导保护性的自噬,自噬抑制剂巴弗洛霉素和氯喹可以增强胆管癌细胞对ABC294640的敏感性。索拉非尼与ABC294640联用后具有协同抑制胆管癌细胞增殖的作用,可能与两者联用后显著抑制STAT3信号通路有关。因此,自噬抑制剂或者索拉非尼与ABC294640的联合使用可能是胆管癌治疗的新的策略。