D-氨基酸作为一种重要的手性平台化合物,广泛应用于医药,食品及农业等行业。海因酶过程是一个由海因消旋酶,D/L-海因酶以及D/L-氨甲酰水解酶组成的级联反应,是一种高效、经济且绿色的合成手性氨基酸的方法。目前,在海因酶过程的应用中,存在D-氨甲酰水解酶的酶活性低和稳定性差等问题,限制了其工业应用。为获得具有高催化活力和稳定性的D-氨甲酰水解酶,本研究通过基因数据库挖掘筛选获得分别来源于Arthrobacter crystallopoietes CGMCC 1.1926和Nitratireductor indicus CGMCC 1.10953的具有较高酶活力和稳定性的D-氨甲酰水解酶,AcHyuC和NiHyuC,并应用于海因酶过程的构建及优化。为进一步提高氨甲酰水解酶的催化效率,以NiHyuC为主要研究对象,对其进行催化活性改造,晶体结构解析及催化机制研究。主要结论如下:（1）D-氨甲酰水解酶的基因挖掘与酶学性质表征:AcHyuC和NiHyuC对底物N-氨甲酰-D-色氨酸（3a）的比活力分别为0.84和1.94 U·mg^–1,均为非金属离子依赖的D-氨甲酰水解酶。最适p H分别为p H 8.5和p H 8.0,最适温度为30°C和35°C,在30°C的t_1/2为12 h和72 h,且均对具有大位阻的N-氨甲酰氨基酸底物表现出偏好性。其中,AcHyuC对3a的k_cat为39.5 min^–1,K_m为1.4 m M,k_cat/K_m为30.4 min^–1·m M^–1,NiHyuC对3a的k_cat为209.9 min^–1,K_m为8.9 m M,k_cat/K_m值为25.7 min^–1·m M^–1。（2）构建了海因酶过程级联反应:将AcHyuC和NiHyuC分别与来源于Arthrobacter aurescens DSM 3747的海因消旋酶（Aa Hyu A）和来源于Agrobacterium tumefaciens BQL9的D-海因酶（At Hyu H）串联构建级联反应。在0.5 L反应体系中,添加10 k U·L^–1Aa Hyu A、5 k U·L^–1At Hyu H和10 k U·L^–1AcHyuC催化80 m M L-吲哚甲基海因（1a）,24 h时D-色氨酸（D-Trp）得率为98.4%,时空产率为36.6 g·L^–1·d^–1。级联反应Aa Hyu A/At Hyu H/AcHyuC和Aa Hyu A/At Hyu H/NiHyuC催化100 m M 1a,24 h时的产物得率分别为81.4%和79.1%。为进一步提高级联反应的反应性能,选取了具有更高比活力和稳定性的NiHyuC进行催化效率改造。（3）NiHyuC野生型晶体结构解析及其分子改造:通过蛋白质结晶获得WT（2.80?）的晶体结构,通过随机突变和基于晶体结构的半理性设计对NiHyuC进行改造。基于九个单突变体,通过组合突变获得最优突变体M4（D187N/A200N/S207A/R211G）。M4的k_cat/K_m为1135.0 min^–1·m M^–1,是WT的44.2倍;K_m值为0.4 m M,是WT的4.5%。在0.5 L反应体系中,添加10 k U·L^–1Aa Hyu A,10 k U·L^–1At Hyu H和60 k U·L^–1 NiHyuC催化160 m M 1a,在12 h时D-Trp得率为99.3%,时空产率为64.9 g·L^–1·d^–1。（4）NiHyuC突变酶晶体结构与催化机制解析:通过蛋白质结晶获得突变体R211G（2.37?）、M3-1（2.70?）和M4（2.14?）的晶体结构。基于晶体结构和分子动力学模拟揭示了loop 200–207在调控底物通道中的重要作用:M4中loop 200–207的灵活性增强且向外摆动,有利于底物进入催化中心。通过预反应状态模型和结合自由能计算证明M4与底物3a更易处于预反应状态,且具有较低的结合自由能,解释了其催化效率提高和K_m值降低的原因。