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大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)是临床上最常见的病原菌之一,其耐药性问题是临床医学的重要挑战。其中,生物被膜(Bacteria Biofilm,BF)的形成是导致E.coli耐药性的主要机制之一,也是慢性传染病复发和难以治疗的主要原因。中药具有来源广、副作用小、效果持久和耐药性低等优点,在应用于抗细菌BF感染方面有着广阔的前景。和厚朴酚(Honokiol)是我国传统中药厚朴的有效成分。现有研究结果表明,Honokiol具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等多种功能。但目前关于Honokiol对E.coli BF的抑制作用研究较少,其作用机制研究尚未见报道。研究表明,药物在亚抑菌和抑菌浓度时,抑制细菌BF形成的作用机制不同。因此,本文对亚抑菌和抑菌浓度的Honokiol抑制E.coli10389 BF形成的作用机制进行较深入的研究,具体研究结果如下:1.通过刚果红平板法和结晶紫半定量法检测E.coli10389 BF的形成过程。结果表明,E.coli10389 BF的形成随着培养时间的增加不断增强,待48 h可形成成熟的BF。2.通过TTC法测定Honokiol抑杀E.coli10389 BF形成和成熟BF的MIC和MBC。结果表明,Honokiol对E.coli10389 BF的形成及成熟BF均有抑制作用。其中,Honokiol抑制E.coli10389 BF形成的MIC和MBC分别32μg/mL和64μg/mL;Honokiol抑制其成熟BF的MIC和MBC分别128μg/mL和256μg/mL。3.通过XTT减低法测定Honokiol对E.coli10389 BF形成的抑制作用,确定Honokiol抑制BF形成效果显著的抑菌浓度和亚抑菌浓度。结果显示,当Honokiol的浓度大于32μg/mL时,浓度的增加对其抑制E.coli10389 BF形成无显著性影响,故选择32μg/mL的Honokiol作为后续研究的抑菌浓度(MIC)。将Honokiol对E.coli10389 BF形成的抑制率为50%和70%时的药物浓度,即8μg/mL和16μg/mL,作为后续研究的亚抑菌浓度(亚-MIC)。4.通过XTT减低法测定亚-MIC和MIC的Honokiol,在不同时间下对E.coli10389 BF形成的影响。结果显示,亚-MIC的Honokiol在0-9 h内,对E.coli10389 BF形成的抑制率随时间的增加而增强,在9-24 h内抑制率无显著性变化。其中,在9 h时,8和16μg/mL的Honokiol对E.coli10389 BF抑制作用效果最好,其抑制率分别为50.01%和75.01%(P<0.01);MIC的Honokiol在0-24 h内,对E.coli10389 BF形成的抑制率随时间增加也不断增强。其中,在24 h时,32μg/mL Honokiol对E.coli10389 BF的抑制作用达到最大值,其抑制率为97.43%(P<0.01)。5.通过分光光度法测定亚-MIC和MIC的Honokiol对E.coli10389生长的影响。结果显示,亚-MIC的Honokiol在0-24 h内对E.coli10389的生长无显著性作用;而MIC的Honokiol对E.coli10389的生长有显著的抑制作用,与对照组相比,在24 h对其抑制率达到了51.46%(p<0.01)。表明MIC的Honokiol抑制菌体的生长是抑制E.coli10389BF形成的作用机制之一;而亚-MIC的Honokiol对E.coli10389 BF形成的抑制作用与菌体的生长无关,是通过其他的调控机制。6.通过qRT-PCR法,检测亚-MIC和MIC的Honokiol对E.coli10389 BF形成相关基因(hha、YbaJ和ariR)mRNA表达量的影响。结果显示,与对照组相比,亚-MIC的Honokiol不影响hha、YbaJ和ariR的mRNA表达量;而MIC的Honokiol可显著影响hha、YbaJ和ariR的mRNA表达量。其中,hha、ariR的mRNA表达量,与对照组相比,分别增加了21.51%和35.99%(P<0.05),YbaJ的mRNA表达量减少了62.02%(P<0.01)。表明MIC的Honokiol可通过影响BF形成的相关基因来抑制E.coli10389 BF的形成;而亚-MIC的Honokiol对E.coli10389 BF的抑制作用与调控BF形成的相关基因表达量无关,是通过其他的调控机制。7.通过qRT-PCR法,检测亚-MIC和MIC的Honokiol对E.coli10389群体感应系统(Luxs/AI-2系统和indole系统)相关基因mRNA表达量的影响。结果显示,亚-MIC和MIC的Honokiol均能抑制Luxs/AI-2系统中的luxs mRNA表达量,但对Luxs/AI-2系统中的pfs和indole系统中的tnaA mRNA表达量影响不大。其中,8、16和32μg/mL的Honokiol对luxs mRNA表达量,与对照组相比,分别减少了26.12%、49.72%和49.77%(P<0.05)。表明亚-MIC和MIC的Honokiol均可通过调控Luxs/AI-2系统中luxs mRNA表达量来抑制E.coli10389 BF形成。8.通过qRT-PCR法检测Honokiol在0-24 h对E.coli10389 luxs基因转录的影响,探讨亚-MIC和MIC的Honokiol影响E.coli10389 BF的形成与luxs的关系。结果显示,亚-MIC的Honokiol在0-9 h对luxs基因转录的抑制作用随时间的增加不断增强,而在9-24 h其抑制作用无显著性变化。其中,8和16μg/mL的Honokiol在9 h时,与对照组相比,可使luxs基因转录分别减少了37.33%和51.10%(p<0.05)。该结果与亚-MIC的Honokiol,在0-24 h对E.coli10389 BF形成的作用效果一致,表明亚-MIC的Honokiol抑制E.coli10389 BF的形成是通过抑制luxs基因的转录来实现的;而MIC的Honokiol在0-24 h内,luxs基因转录的基本无变化,与对照组相比,均减少了约50%(p<0.05)。该结果与MIC的Honokiol对E.coli10389 BF形成的抑制作用,在0-24 h不断增强的结果不同,表明调控luxs基因转录不是MIC的Honokiol抑制E.coli10389 BF形成的主要机制。9.通过生物发光法检测亚-MIC的Honokiol在0-24 h内对E.coli10389 AI-2分泌量的影响。结果显示:亚-MIC的Honokiol在0-9 h内抑制AI-2的分泌量随时间增加而不断增强。但在9-24 h对AI-2的分泌无显著性影响。其中,在9 h时,与对照组相比,8和16μg/mL Honokiol对AI-2的抑制率分别为18.64%和29.32%(p<0.01)。该结果与亚-MIC的Honokiol,在0-24 h对E.coli10389 BF形成的作用效果一致,表明亚-MIC的Honokiol,是通过影响AI-2的分泌量来抑制E.coli10389 BF的形成。10.通过qRT-PCR法,检测亚-MIC Honokiol对AI-2信号分子调控的下游基因(mqsR、qseBC、flhDC、flic、mcbR和csrA)mRNA表达量的影响,探讨其抑制BF形成的作用机制。结果显示,亚-MIC的Honokiol可显著抑制mqsR、mcbR、csrA、flhDC和flic的mRNA表达量,但对qseBC无显著抑制作用。其中,16μg/mL Honokiol对mqsR、mcbR、csrA、flhD、flhC、flic的mRNA表达量,与对照组相比,分别下降了65.21%、55.01%、73.16%、62.01%、60.30%和59.71%(P<0.01)。表明亚-MIC的Honokiol抑制E.coli10389BF形成的作用机制,主要是通过抑制AI-2信号分子调控的荚膜异多糖酸基因(mqsR)、类黏蛋白基因(mcbR)和鞭毛形成相关基因(csrA、flhDC和flic)的mRNA表达量来实现的。综述以上结果,MIC和亚-MIC的Honokiol抑制E.coli10389 BF形成的机制不同。其中,MIC的Honokiol主要是通过抑制菌体的生长和影响BF形成相关基因的mRNA表达量,来抑制E.coli10389 BF的形成;亚-MIC的Honokiol则主要是通过抑制E.coli10389 Luxs/AI-2系统中luxs的mRNA表达量,使AI-2的分泌量减少,降低其下游基因mqsR、mcbR、csrA、flhDC、flic的mRNA表达量,来抑制E.coli10389 BF的形成。