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研究背景和目的:衰老是多种因素共同作用引起的器官、组织的老化及功能衰退。随着生活水平的提高及人口老龄化的加剧,衰老及衰老相关疾病的发病率显著升高。引起衰老的病理因素较多,其中过度的氧化应激反应是引起衰老发生的主要原因之一。NAD~+作为氧化还原反应的关键辅酶在调控细胞代谢中起重要作用。研究表明伴随年龄的增长,细胞内NAD~+含量显著性下降。在哺乳类细胞内,CD38是NAD~+主要水解酶,在调节细胞内NAD~+水平上扮演重要角色。我们前期工作表明,CD38基因敲除鼠明显耐受AngII诱导的心肌肥大,保护心脏缺血/再灌注损伤以及明显减轻高脂饮食诱导的心脏氧化应激损伤。然而,CD38在心脏衰老中的作用尚未见报道。因此,本课题将应用CD38敲减的心肌细胞系,探讨CD38介导的NAD~+代谢途径在心肌细胞衰老模型中的作用及其分子机制,以期为延缓心脏衰老提供新的预防和治疗的作用靶点。实验方法:1.心肌细胞衰老模型的制备及其分析:H9c2细胞和CD38敲减的H9c2细胞分别给予10 g/L的D-半乳糖(D-gal)刺激48h后,使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老情况、通过检测细胞内ROS以及MDA含量反应细胞内氧化应激水平。2.心肌细胞给予NAD~+处理:H9c2心肌细胞分别给予10 g/L的D-gal刺激24小时后,再同时给予1.0 mM NAD~+和10 g/L D-gal处理细胞24 h后收样,用β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞数量、用ROS以及MDA检测试剂盒检测细胞内氧化应激水平等,确定补充NAD~+对D-gal诱导的心肌细胞衰老模型的影响。3.机制分析:(1)利用Western Blot和Q-PCR检测D-gal诱导的衰老模型中衰老相关蛋白p16、p21以及CD38的表达;(2)利用Western Blot检测氧化应激有关蛋白NOX4、SOD2的表达,以及细胞内总蛋白乙酰化水平;(3)给予NAD~+处理细胞后检测衰老以及氧化应激相关蛋白的表达。实验结果:1.D-gal显著增加H9c2心肌细胞的衰老以及衰老相关基因p16、p21的表达,同时增加细胞的氧自由基(ROS)的含量。CD38的mRNA和蛋白水平在D-gal刺激后显著增加。2.年老小鼠心脏组织中衰老相关基因p16的表达显著升高,NAD~+代谢通路关键酶NAMPT及Sirt1的表达显著下降。3.敲减CD38显著改善D-gal诱导的心肌细胞衰老,同时降低衰老相关基因p16、p21的表达。4.D-gal增加细胞总蛋白的乙酰化水平,敲减CD38后细胞乙酰化水平则显著下降。D-gal刺激下,CD38敲减显著降低心肌细胞内ROS以及MDA的含量,同时降低促氧化应激蛋白NOX4的表达以及增加抗氧化应激蛋白SOD2的表达。5.补充NAD~+明显减轻D-gal诱导的心肌细胞衰老,并显著减少细胞内ROS以及MDA的含量,增加抗氧化应激蛋白SOD2的表达以及降低促氧化应激蛋白NOX4的表达。结论:1.CD38在D-gal诱导的心肌细胞中表达上调,NAD~+代谢通路关键酶Sirt1及NAMPT在年老小鼠中表达下降。2.敲减CD38基因显著减轻D-gal诱导的心肌细胞衰老及细胞内氧化应激损伤。3.补充NAD~+明显减轻D-gal诱导的心肌细胞衰老及细胞内氧化应激损伤。