第一部分巨噬细胞异常极化在ITP中的作用及调控研究研究背景:免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是一种常见的自身免疫性出血性疾病,主要表现为患者血小板计数降低,出血风险增高。患者体内自身抗体介导血小板被单核/巨噬细胞过度清除和/或细胞毒性T细胞对血小板的直接杀伤是造成血小板破坏增多的重要原因,而另一方面,免疫介导的巨核细胞成熟障碍、凋亡异常会导致血小板生成不足。其中多种细胞免疫异常,包括Th1/Th2亚群失衡,髓样/淋巴样树突状细胞(myeloid/lymphoid dendritic cells,mDCs/1DCs)比例增高,调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)、耐受性DC细胞数量及功能缺陷等均参与了 IIP的发病。巨噬细胞在固有免疫及适应性免疫中都起到了关键性的作用,然其在ITP发病中的作用还有待研究。根据激活后巨噬细胞的表型及功能可以将其分为两类:经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophage,M1)和替代激活的巨噬细胞(alternatively activated macrophage,M2)。M1 型巨噬细胞由干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)和革兰氏阴性细菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激活化,表现为共刺激分子(CD80,CD86)表达增高,抗原递呈能力增强,分泌大量的促炎性细胞因子,如白细胞介素(interleukin,IL)-12等,发挥Th1型宿主免疫功能。M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13及免疫复合物等刺激活化,表现为甘露糖受体(mannose receptor,MR),清道夫受体(scavenger receptor,SR)表达增高,分泌抗炎性细胞因子,包括IL-10等,诱导Tregs生成,发挥Th2型抗炎作用。M1/M2型巨噬细胞的极化状态能够影响淋巴细胞亚群分化并改变其免疫耐受功能,从而参与了多种自身免疫性疾病的发生发展,如类风湿性关节炎,多发性硬化等。然而,巨噬细胞的异常极化是否参与了 ITP的发病,目前尚缺乏研究证实。大剂量地塞米松(High-dose dexamethasone,HD-DXM)冲击治疗是国际公认的ITP临床治疗的首选方案。然而,HD-DXM治疗ITP的机制尚不完全明确,且仍有约1/3患者长期应用激素治疗无效。近年来,虽然有重组人促血小板生成素受体激动剂(recombinant human thrombopoietin receptor agonist,TPO-RA)、利妥昔单抗等新型药物的出现,部分患者仍对各种治疗反应不佳,迁延不愈进展为难治性ITP。全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是一种诱导分化剂,也是一种免疫调节剂,在多种自身免疫性疾病,包括类风湿性关节炎,狼疮肾炎中取得较好的疗效。Dai等人在最近的研究中发现ATRA联合泼尼松在难治复发性ITP患者中达到54.3%的总体有效率。研究发现,ATRA能够直接诱导T细胞分化,并能诱导DC向耐受性分化。ATRA联合IL-4还能够有效上调小鼠精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)的表达,而Arg-1被广泛认为是小鼠M2型巨噬细胞活化的重要标志之一。然而,ITP中是否存在巨噬细胞异常极化,HD-DXM和ATRA能否通过调节M1/M2极化在ITP中发挥治疗作用,尚需要体内外实验的多方验证。目的:(1)探究ITP中巨噬细胞的极化现象及其功能,明确其在疾病发生发展中的作用。(2)探究HD-DXM或ATRA对巨噬细胞极化及功能的调节作用,揭示HD-DXM和ATRA治疗ITP的可能作用靶点。方法:(1)收集ITP切脾患者及外伤脾破裂患者脾脏各5例,冰冻组织切片,分别标记抗人-CD68、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)或CD163,荧光共聚焦显微镜下计数CD68+iNOS+细胞(M1)和CD68+CD163+细胞(M2)的数量。(2)入组未经治疗的ITP患者20例,采集外周血10ml,分选CD14+单核细胞,体外加入巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导为M0巨噬细胞,并分别以LPS + IFN-γ或IL-4诱导为M1,M2。(3)流式细胞术检测 M1 和 M2 表面 CD163,CD206,CD209,CCR7,CD86 和CD80的表达。(4)酶联免疫标记法(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)测定巨噬细胞培养上清中IL-12、TNF-α及IL-10的含量。(5)将诱导后的巨噬细胞分别与CD4+和CD8+T细胞共培养,5天后流式测定CD4+和CD8+T细胞增殖情况,CD4+CD49b+LAG-3+调节性T细胞(Type Ⅰregulatory T cell,Tr1)的比例。(6)收集巨噬细胞与CD4+ T细胞共培养上清,多因子试剂盒检测辅助性T细胞Th1/Th2相关细胞因子的含量。(7)上述20例未经治疗的ITP患者经HD-DXM治疗,另收取激素治疗无效的ITP患者23例,应用ATRA +泼尼松联合用药,分别收集两种药物治疗前后患者的外周血,体外诱导为M1,M2,测定其表型及对CD4+T细胞增殖的影响。结果:(1)荧光共聚焦显微镜显示ITP患者M1数量高于脾破裂患者(5.4 ± 0.9 vs 2.8±0.8,P<0.05),M2 数量未见明显差别(3.0 ±0.7 vs 3.2 ±1.3,P>0.05)。(2)流式结果显示ITP患者来源的M1和M2表面CD86和CD80的表达明显高于正常人;经DXM和ATRA干预后,M1和M2表面CD86,CD80,趋化因子受体 7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)的表达均降低,且 DXM 干预后CD163表达增加,ATRA干预后CD209的表达增加。(3)ELISA结果显示与正常对照相比,ITP来源的M1和M2分泌IL-12p70,TNF-α显著增高;经DXM或ATRA干预后的M1,M2分泌IL-12p70和TNF-α减少,而IL-10增加。(4)将巨噬细胞与T细胞共培养后,流式细胞术检测显示ITP患者来源的巨噬细胞刺激T细胞增殖的能力明显高于正常人;经DXM或ATRA调控的M1,M2对CD4+和CD8+ T细胞增殖表现出明显的抑制,且DXM或ATRA调控后的M2巨噬细胞能显著扩增Tr1细胞亚群。(5)检测共培养上清中Th1/Th2细胞因子的表达,结果显示DXM预处理的ITP患者M1和M2细胞能够增加CD4+T细胞分泌IL-4,IL-5和IL-13的能力并减少IFN-γ,IL-2和IL-12的分泌。ATRA预处理的ITP患者M1和M2同样增加CD4+T细胞分泌IL-4,IL-5和IL-13并减少IL-2和IL-12的分泌,然而只有ATRA预处理的M2型巨噬细胞能够减少CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力。(6)本研究中,HD-DXM在未经治疗的ITP中总体有效(overall response,OR)率为85%,且治疗有效患者治疗后外周血单核细胞来源的M1和M2表面CD86,CD80,CCR7的表达均降低,CD163表达增加,与CD4+T细胞共培养后,刺激CD4+T细胞增殖的能力减弱;ATRA应用于难治性ITP中,OR率为69.6%,治疗有效者治疗后单核细胞来源的M1和M2表面CD86,CD80,CCR7的表达均降低,CD209表达增加,与CD4+T细胞共培养后,明显降低CD4+T细胞增殖能力。治疗无效者治疗前后巨噬细胞表型及功能均无明显差异。结论:(1)ITP中存在巨噬细胞向M1型过度极化的现象,且患者巨噬细胞免疫耐受功能受损。(2)HD-DXM或ATRA能够纠正ITP患者体内巨噬细胞的极化异常,诱导其向M2型极化,重塑机体免疫耐受。(3)这一研究揭示了 ITP发病的新机制,并证明了巨噬细胞为HD-DXM及ATRA在ITP中发挥治疗作用的靶点之一。第二部分HLA-G表达异常在ITP发病中的作用及调控研究研究背景ITP是一种常见的自身免疫性疾病,免疫失耐受是ITP中血小板破坏的重要原因之一。多种免疫调节细胞异常,包括自身反应性T、B细胞过度活化扩增,调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)、调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)、耐受性树突状细胞(dendritic cells,DCs)、髓源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)数量及功能异常等,致使机体免疫耐受不能维持。继而自身免疫紊乱导致血小板被过度破坏,且巨核细胞成熟障碍造成血小板生成不足。人白细胞抗原 G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)是一种非经典 HLAI类分子,包括膜结合型HLA-G(membrane-bound HLA-G,mHLA-G)和可溶性HLA-G(solubleHLA-G,sHLA-G)两种形式。目前发现的能够识别并结合HLA-G分子的免疫球蛋白样受体主要有三种:免疫球蛋白样转录物2(immunoglobulin-like transcript 2,ILT2/CD85j)、免疫球蛋白样转录物 4(immunoglobulin-like transcript 4,ILT4/CD85d)及杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR2DL4/CD158d)。上述受体在 T、B淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、自然杀伤性细胞(natural killer cells,NKs)表面存在差异性表达。研究发现,多种细胞可分泌或表达HLA-G,并通过与上述细胞表面的耐受性受体结合发挥免疫调节作用。自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等患者体内均存在HLA-G表达及功能异常,致使机体免疫失耐受或发生炎性紊乱。然而,HLA-G在ITP中的作用尚有待研究。目的:(1)探究HLA-G及其受体在ITP中的表达,并明确其在各种免疫细胞中的作用。(2)剖析体外应用重组人 HLA-G 蛋白(recombined human HLA-G,rhHLA-G),对纠正ITP免疫细胞功能异常的作用及机制,探寻ITP治疗的新靶点。方法:(1)收集30例ITP患者和15例正常对照的外周血,分离血浆、血小板、单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),免疫磁珠分选 CD14+单核细胞。(2)改良单克隆抗体血小板抗原固定试验(modified monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigens,MAIPA)测定ITP患者抗血小板特异性自身抗体的表达。(3)酶联免疫标记(enzyme-linked immunoabsorbent assay,ELISA)测定 ITP 患者及正常对照血浆中sHLA-G的表达。(4)PBMC中加入外源性rhHLA-G培养3天后,流式细胞术测定CD4+、CD8+T淋巴细胞,CD14+单核细胞和CD19+B淋巴细胞表面mHLA-G和ILTs的表达,流式细胞术测定CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例变化。(5)将rhHLA-G治疗3天后的PBMCs与自体或异体血小板共培养4小时,线粒体膜电位检测试剂盒(mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)测定血小板凋亡。(6)CD14+单核细胞加入粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和 IL-6,培养 5 天后,加入 LPS 和 rhHLA-G,继续培养48小时,收集DCs,测定DCs表面CD86、CD80的表达。结果:(1)抗血小板自身抗体阳性的ITP患者体内HLA-G表达较正常人明显降低,而抗体阴性者与正常人无明显差异。(2)与正常对照相比较,ITP患者CD4+T细胞和CD19+B细胞表面mHLA-G和ILT2表达明显降低,CD14+单核细胞mHLA-G和ILT4表达降低。rhHLA-G能够上调上述细胞表面ILTs的表达。(3)rhHLA-G能够减少ITP患者PBMCs对自体及异体血小板的杀伤作用。(4)rhHLA-G能够降低DCs表面CD86和CD80的表达。(5)rhHLA-G 不能扩增 ITP 患者体内 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 细胞。结论:(1)ITP中HLA-G和其抑制性受体ILTs表达降低。(2)rhHLA-G能够上调抑制性受体的表达,增强免疫细胞的抑制功能。(3)这一研究揭示了 ITP发病的新机制,为ITP的治疗提供了新思路。