研究背景和目的长期以来,医学界一直认为,神经细胞属于一种永久细胞,缺乏再生能力,神经损伤是不可逆转的。尽管早期有许多学者指出,哺乳动物可能具备成年神经再生的能力,但是由于检测技术的落后,这些假说迟迟未能得到证实。近年研究表明,成年中枢神经系统仍有神经再生。成年神经再生,包括神经干细胞的增殖、分化、成熟及向神经回路整合四个步骤。GABA信号通路被认为是目前与成年神经再生关系最密切的通路之一,在神经干细胞的增殖、存活、分化等方面均有重要的作用。七氟烷是一种诱导迅速,无恶味,麻醉深度易掌握的近几年步入临床的吸入麻醉药。因其具有全麻诱导快,苏醒迅速,对呼吸道无刺激,肌松作用好,对循环影响小等一系列优点,如今临床应用较为广泛。而目前其在成年神经再生中的作用的研究仅仅观察了活体内的作用,并未考虑复杂的体内微环境可能产生的复杂影响。本研究的目的就是通过制备四血管夹闭大鼠全脑缺血模型,在体外观察七氟烷对成年神经再生的作用;然后通过体外培养细胞模型研究七氟烷对成年神经干细胞的直接作用,选择了同时参与了GABA和Wnt信号通路的CREB作为候选信号分子,对七氟烷在成年神经再生中的作用和可能的机制进行探讨。材料和方法1.实验分组SPF级SD雄性大鼠50只,体重250±20g,随机分为5组,每组10只,第一组:七氟烷(3.5ml/kg)+四血管夹闭大鼠全脑缺血模型组;第二组:七氟烷(3.5ml/kg)+假手术组;第三组:七氟烷(7ml/kg)+四血管夹闭大鼠全脑缺血模型组;第四组:七氟烷(7ml/kg)+假手术组;第五组:生理盐水+四血管夹闭大鼠全脑缺血模型。采用腹腔注射给药(3.5ml/kg或7ml/kg),各组动物手术前均连续给药7天,于第7天给药后1 h造模。2.实验方法2.1四血管夹闭大鼠全脑缺血模型的制作制作模型前一天大鼠被禁食过夜,以保证均一的血糖水平。手术前给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛(40mg/100g体重),待大鼠瞬目反射消失,剪掉颈前毛,酒精消毒后切开前颈皮肤,钝性分离暴露双侧颈总动脉后用手术缝线做好标记,关闭切口。将大鼠固定在大鼠脑立体定位仪上,剪掉后颈毛发,酒精消毒后沿着正中线切开皮肤,钝性分离暴露双侧椎动脉,使用25W电烙铁短暂热凝永久阻塞椎动脉,用1ml皮试注射器针头探查阻塞确实后关闭切口。当夜给予大鼠少量食物和水。第二天,将清醒动物固定后,消毒手术区,打开颈前切口,利用标记用手术缝线将动脉夹放置在双侧颈总动脉上夹闭15分钟,由于颈动脉和椎动脉此时皆已关闭,造成大鼠大脑缺血,表现为意识丧失,角膜反射、翻正反射消失,瞳孔散大,无癫痫、抽搐、呼吸暂停、口鼻血性泡沫痰、大小便失禁等过度损伤表现,不符合以上表现的被排除出缺血损伤组,期间适时给予电热毯保温保证肛温与正常大鼠相同。夹闭结束取出动脉夹,使大鼠脑血流灌注恢复并形成缺血再灌注损伤,关闭切口,将手术后动物放置在温暖干燥的环境中,给予自由的饮水饮食。第二天只打开颈前切口,而不夹闭颈总动脉的大鼠归入假手术组。2.2 BrdU标记和海马组织冰冻切片的制备各组大鼠分别于手术处理后腹腔注射BrdU(100mg/kg),连续3天。28天后,各组大鼠分别腹腔注射10%水合氯醛(40mg/100g体重),待大鼠瞬目反射消失,4%多聚甲醛经心脏灌注固定,取脑修块后,再用4%多聚甲醛后固定4-6小时,流水冲洗1-2小时,30%蔗糖PBS溶液中脱水2-3天直至脑块沉底,随后取出在冰冻切片机上选取海马形态典型的冠状切面切成20μm薄片后贴至涂有明胶的载玻片上,在室温下晾干2小时后微波炉中火5分钟烤片,以确保脑片贴合牢固,同时可以修复抗原以备免疫组织化学检测用。2.3免疫组化染色a.各组切片先用2N HCl在37℃处理30min,0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)处理10min;b.0.1M PBS(pH7.4)冲洗3×10min;c.室温下封闭液孵育2h(0.3%Triton X-100,0.1%BSA和2%normal goat serum溶于PBS);d.BrdU:BrdU一抗4℃孵育24h;NeuN:NeuN一抗4℃孵育24h;BrdU/NeuN双标:同时用BrdU和NeuN一抗4℃孵育24he.0.1M PBS(pH7.4)冲洗3×10min;f.BrdU:BrdU二抗室温下避光孵育2b;NeuN:NeuN二抗室温下避光孵育2h;BrdU/NeuN双标:同时用BrdU和NeuN二抗室温下避光孵育2h;g.0.1M PBS(pH7.4)冲洗3×10min;h.刷片,空气中干燥24h;i.二甲苯透明后,中性树脂封片,干燥后备镜检各组均设立不加一抗和不加二抗两组对照。2.4阳性细胞计数应用图像分析软件AlphaEase FC在光镜(20×)下计数各组切片大鼠海马齿状回SGZ(Subgranular Zone)BrdU阳性细胞数量,计算各组大鼠海马齿状回SGZ(Subgranular Zone)BrdU阳性细胞数量的算术平均值。3、成年神经干细胞培养和鉴定冻存的成年海马神经干细胞(SCR022)复苏后,重悬在新鲜配制的含有20ng/mL FGF-2的培养液中,在铺有L-鸟氨酸的培养板里培养,每天换液。免疫细胞化学鉴定方法如下:培养细胞弃去培养液后用预冷的4%多聚甲醛PBS固定,含0.3%Triton的5%BSA封闭25℃60分钟,Nestin抗体孵育过夜,TRITC二抗孵育,DAPI复染细胞核,在荧光显微镜下观察,红色荧光阳性的细胞即为Nestin阳性成年神经干细胞,蓝色为DAPI染色的细胞核。4、实验方法4.1七氟烷处理神经干细胞细胞铺板,2小时后在显微镜下观察细胞是否贴壁,贴壁后,将细胞放入预先制备的密闭容器中,容器中七氟烷浓度分别为1.3%,1.9%,2.7%和3.3%(容器内还含5%CO2,20%O2,并在一个大气压下用氮气平衡),其中1.3%为低浓度组,1.9%和2.7%为中浓度组,3.3%为高浓度组,不含七氟烷作为空白对照组,继续培养细胞2小时。4.2神经干细胞核染色和细胞计数细胞固定后,加入DAPI染色15分钟。每组重复计数4孔细胞,每孔细胞镜下(400×)随机选择四个视野,进行细胞计数,并相加作为该孔的细胞总数。每组4孔的细胞总数相加后取平均数代表该组的细胞总数,空白组的细胞经标准化处理后记为100。4.3免疫印迹CREB和pCREB的表达水平用免疫印迹方法测定。将细胞分为三组:空白组(不加任何处理),低浓度七氟烷组(1.3%七氟烷处理)和中浓度七氟烷组(1.9%)。含1mM Na3VO4预冷的PBS洗细胞2次,再用预冷的缓冲液裂解细胞,收集细胞裂解液,SDS-PAGE电泳分离后转印于PVDF膜上,5%脱脂奶封闭后,将PVDF膜与含CREB(1:1000)或pCREB(1:1000)抗体的3%BSA中4℃孵育过夜,再分别加入二抗和化学发光试剂,获得图像。观察pCREB和CREB灰度比值来评判CREB的磷酸化水平,空白对照组比值标准化为100,其余组依此标准化。5.统计方法各组数据应用采用SPSS 13.0统计软件进行分析,所有实验数据均采用平均数±标准误(Mean±SE)表示,检验方差齐性后(P＞0.05),采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)的统计学方法,P＜0.05被认为有显著性差异,各组均数间的多重比较采用LSD法(Least-significant difference test)。结果1.大鼠腹腔注射七氟烷对齿状回神经元增殖的影响应用LSD法对各种新生神经元数量进行组间比较,应用3.5ml/kg七氟烷的缺血组与假手术组和生理盐水对照组均存在统计学差异,应用7ml/kg七氟烷大鼠的缺血组与假手术组和生理盐水对照组也均存在统计学差异,分别应用3.5ml/kg和7ml/kg七氟烷的缺血组之间存在统计学差异,两假手术组与生理盐水对照组不存在统计学差异。2.大鼠成年海马神经干细胞的体外培养及鉴定体外培养的成年神经干细胞表达Nestin蛋白,阳性率为99%。3.七氟烷促进成年神经干细胞增殖低浓度七氟烷组(1.3%)无促进ANSCs增殖的作用,而中浓度组(1.9%和2.7%)与空白对照组相比,明显可以促进ANSCs增殖(P＜0.05),高浓度组(3.3%)与中浓度组相比也显著促进ANSCs的增殖(P＜0.05)。可见,七氟烷促进ANSCs增殖的效应呈剂量依赖性。4.七氟烷上调环磷腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化水平为了明确CREB中七氟烷促ANSCs增殖中的作用,应用Westernblot检测ANSCs中CREB和磷酸化CREB(pCREB)的表达水平。中浓度组七氟烷明显上调ANSCs中p-CREB/CREB的比值。结论1、腹腔给予四血管夹闭大鼠全脑缺血模型七氟烷3.5ml/kg和7.0ml/kg均可促进大鼠海马齿状回的新生神经元数目增多,说明七氟烷可以促进成年神经再生,且这种促进作用可能具有浓度依赖性。本研究中七氟烷对假手术组大鼠的成年神经再生无明显影响,这可能是由于七氟烷产生成年神经再生作用需要一定的刺激。2、在本研究的体外实验中,我们发现七氟烷在中浓度(1.9%和2.7%)和高浓度(3.3%)可以促进ANSCs的增殖,而空白对照组和低剂量(1.3%)无明显作用。证明了七氟烷可以促进的ANSCs增殖。3、CREB的磷酸化与ANSCs的增殖一直是密切相关的。本研究结果表明七氟烷可能是通过改变CREB的活性,达到促ANSCs增殖的作用。