恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病。早期诊断与早期治疗恶性肿瘤对提高患者的生存率和生活质量具有至关重要的作用。以超声、CT、MRI等为代表的传统医学影像技术能够直观地显示一定体积以上肿瘤的形态学表现。而面对早期或疑似的肿瘤性病变,几乎都依靠普通造影剂进行血池灌注显像来比较组织器官在生理和病理状态下的血流动力学差异,从而做出定性诊断。然而,由于普通造影剂对病变组织缺乏特异性亲和力,不能有效驻留于靶组织,只能在短暂的动脉相中对组织、器官产生一过性增强,因此对疾病诊断的特异性欠佳。如何及时、准确地观测到活体内肿瘤组织在分子及细胞水平的变异信息,一直是医学科研者们亟待攀登的高峰。超声分子影像学为非侵入性地对活体内参与生理和病理过程的分子进行定性或定量可视化提供了一种全新的科学观察方法与手段。其原理是:经静脉注入带有特定配体的靶向超声造影剂,在体内通过配体与受体结合的方式,使之特异性结合并较长时间停留于靶组织,从而在超声检测中观察到靶组织在分子水平的成像,以此来反映病变的分子病理基础。实体肿瘤在生长与转移的过程中均依赖新生血管形成。血管系统在肿瘤发生、发展过程中具有至关重要的作用。研究表明,血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,VEGFR2)在肿瘤新生血管内皮细胞表面高度表达,而在正常组织表达高度保守。VEGFR2介导了形成肿瘤新生血管必需的所有内皮细胞功能,其表达强度和表达率已被看作评估肿瘤预后与转移的指标之一。它本身亦成为抗肿瘤血管生成治疗的重要靶点。鉴于肿瘤新生血管内皮高度表达VEGFR2,而VEGFR2的水平可反映肿瘤预后与转移的趋势,以及超声分子显像提供了一种无创性检测活体组织在分子或细胞水平变异的方法,本课题拟制备一种携带抗VEGFR2单抗的靶向超声微泡造影剂,在小鼠H22移植瘤模型上观察其特异性增强显像活体肿瘤的效果与能力;并进一步尝试应用超声分子显像的方法评估肿瘤新生血管VEGFR2表达水平动态变化的可行性与准确性,以期为早期、特异性诊断恶性肿瘤开拓一项新的思路与新的手段,为指导抗肿瘤血管生成治疗与疗效评估提供更加充分、可靠的依据。除了对上述内容进行全面探讨以外,本课题还直接靶向肿瘤细胞开展了血管外超声分子显像的前期探索性研究。因为靶向VEGFR2超声分子显像是针对肿瘤新生血管内皮表面的特异性受体VEGFR2而发生的血池内显像,它虽然可以有力地提高超声对肿瘤的检出率,但我们并无法从中获知直接来自肿瘤细胞自身的信息。而人类对恶性肿瘤的执着探索还希望能够直接针对肿瘤细胞分子显像,以便更全面地认识肿瘤生长特点与规律。血管外超声分子显像如果得以成功实现,必将带来直接展示肿瘤细胞的更直观、更丰富的讯息。根据大量研究表明,叶酸受体在卵巢癌、子宫内膜癌等绝大多数恶性上皮性肿瘤组织高度表达;同时,叶酸与单克隆抗体相比,具有分子量小,到达靶点时间短,血液清除速度快,穿透力强,几乎无免疫源性等优点。因此,我们拟制备一种叶酸靶向超声微泡造影剂,在高度表达叶酸受体的卵巢癌SKOV3细胞株上探讨了该造影剂的主动寻靶能力,以期为血管外靶向肿瘤细胞建立一种理想的分子探针,为将来开展血管外超声分子成像研究奠定扎实的前期实验基础。综上所述,本课题主要包括以下四部分内容。第一部分携带抗VEGFR2单抗靶向超声造影剂的制备及体外性质鉴定目的制备靶向肿瘤新生血管VEGFR2的超声微泡造影剂,并对其基本物理性质与免疫学活性进行鉴定。方法通过生物素-链亲和素桥接构建携带抗VEGFR2单抗的靶向超声微泡造影剂。应用DFY型超声图像定量分析诊断仪(以下简称“DFY软件”)检测造影剂的粒径与浓度。通过免疫荧光法鉴定其活性。结果携带抗VEGFR2单抗超声微泡的基本物理性质与普通微泡相似。该靶向微泡在体外可以与相应的二抗发生特异性结合,具有良好的免疫学活性。结论成功制备了携带抗VEGFR2单抗的靶向超声微泡造影剂。该造影剂具有特异性增强显像肿瘤新生血管的潜能。第二部分靶向VEGFR2超声微泡造影剂增强显像小鼠H22移植瘤目的探讨靶向VEGFR2超声微泡造影剂结合超声造影技术增强显像小鼠H22移植瘤的效果与能力。方法建立小鼠H22移植瘤模型,分别注射靶向VEGFR2微泡或普通对照微泡进行超声造影检查。应用DFY软件量化分析造影图像的视频强度变化,并描绘时间-强度曲线。用荧光素标记微泡进行体内示踪实验,观察两种微泡在体循环7 min后在血管内的分布。免疫组化法检测肿瘤组织内VEGFR2表达情况。结果时间-强度曲线表明靶向微泡造影组较对照组达峰时间提前,峰值更高,持续时间更长。荧光标记微泡的体内示踪实验显示,在体循环7 min后,普通微泡在肿瘤血管内基本被清除,而靶向微泡仍有部分黏附于肿瘤血管内壁。免疫组化证实肿瘤组织内部高度表达VEGFR2。结论靶向VEGFR2超声微泡造影剂结合超声造影技术可较普通微泡造影剂更特异性地显像小鼠H22移植瘤。该靶向造影剂是一种良好的肿瘤新生血管分子探针。第三部分超声分子显像评估小鼠H22移植瘤新生血管VEGFR2动态变化目的探讨用超声分子显像的方法在体无创性评估小鼠H22移植瘤新生血管VEGFR2表达水平动态变化的可行性与准确性。方法分别建立生长1周、2周、3周及4周的小鼠H22移植瘤模型,经尾静脉注射靶向VEGFR2微泡或普通对照微泡,在“充盈-击碎微泡-再充盈”模式下进行超声造影检查。应用DFY软件分别测量肿瘤组织在击碎微泡前、后的视频强度值(VI),以二者之差即视频强度差值(VId)代表粘附于血管内壁的微泡信号。通过Western Blot半定量检测各组肿瘤VEGFR2表达水平。对4个时期肿瘤造影的平均视频强度差值(mean VId)与相应VEGFR2表达水平进行相关性分析。结果在靶向造影组,第2周肿瘤mean VId最高,而第4周最低(P<0.01);4个生长时段肿瘤靶向造影的mean VId与相应VEGFR2表达水平之间呈显著正相关关系(r=0.866,P<0.01)。而在对照组内,mean VId在4个时期肿瘤之间呈小范围波动,以第4周肿瘤mean VId最高(P<0.01);但对照组造影的mean VId与VEGFR2表达水平之间无相关关系(P>0.05)。结论应用超声分子显像方法可以较准确地评估小鼠H22移植瘤新生血管VEGFR2表达水平的动态变化。该方法可能作为一种新型监控手段,为指导抗肿瘤血管生成治疗与疗效评估提供更充分、可靠的依据。第四部分靶向叶酸受体血管外超声分子显像的前期探索性研究目的制备偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂,鉴定其基本物理性质,并在体外培养的卵巢癌细胞上考察其主动寻靶能力。方法将DSPE-PEG(2000)Folate溶入微泡成膜材料中,制备叶酸靶向超声微泡造影剂。用DFY软件检测微泡的粒径与浓度。体外培养高度表达叶酸受体的卵巢癌SKOV3细胞。通过光镜和激光共聚焦显微仪分别探究叶酸靶向超声微泡对SKOV3细胞的主动寻靶能力及机制。结果叶酸靶向微泡的基本物理性质与普通微泡相似。体外寻靶试验显示,该靶向微泡可以较多并牢固地结合于SKOV3细胞表面;而在加入游离叶酸干扰后,该结合可以被竞争性阻断。但在普通微泡对照组始终未观察到微泡与SKOV3细胞结合。结论成功制备了偶联叶酸的靶向超声微泡造影剂。该造影剂在体外对高度表达叶酸受体的卵巢癌SKOV3细胞具有极强的特异性亲合力。它有望成为一种理想的血管外超声分子探针,特异性增强显像高表达叶酸受体的肿瘤组织。