【摘 要】
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干扰素(Interferon, IFN)是由特定细胞产生的一类具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的分泌型糖蛋白,是机体防御系统的重要组成部分。近年来,由于干扰素具
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干扰素(Interferon, IFN)是由特定细胞产生的一类具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的分泌型糖蛋白,是机体防御系统的重要组成部分。近年来,由于干扰素具有无药物残留,无毒副作用的特点,使其在防治畜禽疫病特别是病毒性疫病方面越来越受到关注。但是犬干扰素-α(CaIFN-α)的研究和应用相对落后。1.为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素,在犬肝脏组织中克隆获得犬α干扰素第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过融合PCR的方法在犬α干扰素的N端无缝连接内含肽Ssp DnaB intein (SDI)基因,然后连接入pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的重组表达载体。重组载体在大肠杆菌感受态Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。重组蛋白在MDCK上对CDV及VSV的抑制活性分别为3.5×105U/mg和3.9×105U/mg。2.为了使表达的犬α干扰素具有无冗余氨基酸的N端,本研究将犬α干扰素基因连接入pPICZαA载体的分泌信号肽序列后,用LiCl转化法转化入酵母菌GS115中,对培养基上清进行简单处理进行SDS-PAGE分析,表达的蛋白约25ku。分析原因,是由于在犬α干扰素基因序列中有2个潜在的糖基化位点,表达产物被糖基化修饰。酵母表达的犬α干扰素在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分别为9.6×106U/mg和1.1×107U/mg。选择9株重组酵母中表达量最高的9号重组酵母进行发酵罐扩大培养,对发酵培养产物进行SDS-PAGE和抗病毒活性分析,证实其在MDCK上抑制CDV及VSV的活性分别为2.1×106U/mg和2.6×106U/mg。
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