论文部分内容阅读
海藻糖是一种安全无毒的非还原性二糖,具有稳定和保护生物体或生物大分子等特殊性质,可应用于食品、化妆品、生物制剂、医药和农业等行业。海藻糖能够以淀粉为底物,在麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）的催化作用下制得,成本低廉,生产潜力大。然而,在反应体系中常常会残留麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子量麦芽寡糖副产物,制约着海藻糖产量的提升。添加糖基转移酶,通过其糖基转移反应延长这些低分子量麦芽寡糖的链长,使之能够被MTSase和MTHase进一步催化利用,从而能够提高海藻糖产率。本研究选取了7种不同来源的糖基转移酶应用于海藻糖的制备,从中获得了应用效果最佳的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶（BcCGT）。考察了酶反应结束后的体系组分,发现仍剩余较多以麦芽糖为主的低分子量麦芽寡糖。为了继续提高底物利用率,进一步通过定向进化获得了对麦芽糖受体亲和性增强的突变体M234I,提升了海藻糖产率。在此基础上,将突变体M234I在枯草芽孢杆菌进行重组表达,并在3 L罐水平上实现了突变体M234I的高效制备。主要研究结果如下:（1）合成了源自Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidus和Corynebacterium glutamicum的三种4-α-糖基转移酶（4αGTase）基因并以大肠杆菌为宿主进行异源表达。考察了其与本实验室前期重组表达的源自Paenibacillus macerans、Bacillus stearothermophilus和Bacillus circulans的三种环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）和源自Thermus aquaticus的4-α-糖基转移酶对海藻糖制备的影响,并进行了各酶添加量的优化。结果表明,以浓度为150 g·L-1,DE值16的麦芽糊精为底物时,加入1.8 U·mL-1的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶（BcCGT）时海藻糖产率最高,达到了74.1%,相比对照提高了24.0%。分析酶转化液组分发现,当在反应体系中加入糖基转移酶时,海藻糖含量越高,则葡萄糖含量越多,而麦芽糖和麦芽三糖等低分子量麦芽寡糖越少,同时发现麦芽糖在这些低分子麦芽寡糖中占比最高。（2）为进一步提高海藻糖产率,以大肠杆菌E.coli BL21（DE3）为表达宿主,设计和构建了以提高BcCGT对麦芽糖受体亲和力为目的的高通量筛选体系。经过多批筛选后,获得了一株对麦芽糖受体亲和力提高的突变体M234I,并对野生型酶和突变体进行了分离纯化和酶学定性,发现突变体M234I以麦芽糖为受体的Km降低至野生型的54.4%。将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,海藻糖转化率进一步提高至77.2%,分析酶反应结束后的组分,发现体系内的葡萄糖和海藻糖含量增加,麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子麦芽寡糖减少。（3）构建带有突变体M234I基因的质粒pHY300PLK-bccgtM234I的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I,并优化了重组菌的摇瓶发酵培养基,确认最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为比例为7:1的隆科特玉米浆与大豆蛋白胨。对重组菌在3 L发酵罐中进行发酵并优化了补料培养基的碳氮比,当碳氮比为3:1,最高酶活达到1423.2 U·mL-1。