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第一部分调节性B细胞在Graves病发病中的作用及机制研究(一)Graves病患者外周血调节性B细胞的表型鉴定及数量分析[目的]通过体外实验确定Graves病患者外周血调节性B细胞归属的亚群,比较Graves病患者和健康志愿者外周血调节性B细胞亚群数量的差异；[方法]本课题组自2011年2月至2011年11月在内分泌科门诊及病房入选Graves病初发患者15例、病情控制患者19例、健康志愿者36例。收集受试者外周血,分离外周血单个核细胞,加入CpG+PIB培养5小时,流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19-IL-10调节性B细胞的百分含量；流式细胞分选仪分选CD19+B淋巴细胞,Real-Time PCR检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+B淋巴细胞的IL-10mRNA表达水平的差异；比较IL-10+及IL-10-外周血单个核细胞各种分化抗原标志(CD19、CD24、CD38、IgM、IgD、CD5、CD10、 CD27、CD1d)银光强度的差异,确定Graves病患者外周血调节性B细胞归属的亚群,并用流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血调节性B细胞亚群百分含量的差异；[结果]Graves病初发患者外周血CD19-IL-10+调节性B细胞百分含量及IL-10mRNA表达水平比病情控制患者和健康人明显减少(P<0.05)；Graves病患者外周血CD19+CD24+CD27-B细胞亚群属于调节性B细胞,Graves病初发患者外周血CD19-CD24biCD27+B细胞百分含量比病情控制患者和健康人明显减少(P<0.05)。[结论]Graves病患者外周血CD19-IL-10调节性B细胞和ICD19-CD2biCD27-B细胞亚群的百分含量较病情控制患者和健康人明显减少,这表明调节性B细胞在Graves病的发病中可能起到了一定作用。(二)Graves病患者外周血调节性B细胞的功能分析及机制研究[目的]比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞对CD4+T细胞免疫抑制功能的差异,并探讨其发挥免疫抑制作用的途径；[方法]本课题组自2011年7月至2011年12月在内分泌科门诊及病房入选初发患者6例、病情控制患者6例、健康自愿者6例。收集受试者外周血,分离纯化的外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞及CD4+T细胞共培养,培养液中加入CpG.CD40L和抗-CD3共培养5天,最后6小时加入PIB, BrdU ELISA方法检测Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+T细胞增殖水平,流式细胞仪检测并比较Graves病患者和健康志愿者外周血CD4+IFN-γ-和CD4+TNF-α‘百分含量的差异；在共培养体系中加入IL-10抗体,探讨IL-10在CD19+CD24hiCD27’B细胞发挥免疫抑制功能中所起的作用；流式细胞仪检测共培养体系中CD4+CD25hiCD127loFoxp3+调节性T细胞含量,探讨调节性T细胞在CD19+CD24hiCD27+B细胞发挥免疫抑制功能中所起的作用；[结果]与健康志愿者比较,Graves病初发和病情控制患者CD19+CD24hiCD27+B细胞分泌IL-10明显减少(P<0.05),Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群对CD4*T细胞增生和分泌IFN-γ、TNF-α的抑制作用明显减弱(P<0.05)。外周血中CD19+CD24hiCD27+B细胞通过IL-10抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ,但不通过IL-10抑制CD4+T细胞增生和CD4+T细胞分泌TNF-α;和健康志愿者比较,Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群诱导产生CD4+CD25hiCD127loFoxD3+调节性T细胞的数量减少导致其免疫抑制功能下降。[结论]Graves病初发和病情控制患者外周血CD19+CD24hiCD27+B细胞免疫抑制功能较健康人明显减少,这表明调节性B细胞在Graves病的发生、发展过程中可能起到了一定作用。病情控制的患者CD19+CD24hiCD27+B细胞亚群的免疫抑制功能仍明显低于正常人,这说明目前临床常用的药物能使Graves病患者本身的免疫缺陷部分改善,但不能得以完全恢复。第二部分调节性T细胞在Graves病发病中的作用[目的]通过对不同阶段Graves病患者外周血中淋巴细胞亚群数量以及CD4+CD25+调节性T细胞功能的测定,研究调节性T细胞在Graves病发病中的作用。[方法]采集初发、病情控制的Graves病患者组以及健康人组等3组人群的外周血。流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群的百分率,Real-Time PCR检测外周血单个核细胞的Foxp3mRNA;免疫磁珠体外分离CD4+CD25+调节性T细胞,应用MTT法检测其对CD4+CD25-T细胞的免疫抑制功能。[结果]和健康人相比,Graves病初发患者外周血中的CD3+CD4+T和CD3-CD19+B细胞均显著增加(P<0.05)；CD3-CD16+CD56+NK细胞则显著减少(P<0.05)；而病情控制患者各淋巴细胞亚群无明显变化。Graves病初发和病情控制患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞数量及Foxp3mRNA表达水平和健康人之间虽无明显变化,但他们的免疫抑制功能明显下降,其中初发患者调节性T细胞的免疫抑制功能比病情控制患者明显下降(P<0.05)。[结论]Graves病患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制功能的减弱导致CD4+T淋巴细胞增殖的失控可能是Graves病的发病原因；经药物治愈患者调节性T细胞的免疫抑制功能难以完全恢复正常可能与Graves病容易复发有关。