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1.目的: 通过研究中药复方 861 对人肝星状细胞 LX-2 增殖、活化以及胶原合成和降解相关基因和蛋白表达的调节作用,从细胞和分子水平探讨该药物抗纤维化的作用机理;同时构建抗纤维化药物筛选平台,为进一步筛选有效抗肝纤维化药物提供基础。2.方法:2.1 用 MTS 方法检测复方 861 对 LX-2 细胞增殖的影响 首先通过预试验对 MTS 孵育时间和接种的细胞数等实验条件进行了优化,并通过 MTS 方法测定了复方 861 对人肝星状细胞 LX-2 的细胞毒作用。在此基础上,选取细胞存活率在 85%以上的浓度作为实验用药剂量,检测了不同浓度复方861 对人肝星状细胞 LX-2 和人肝癌细胞 HepG2 细胞增殖的影响。2.2 实时定量荧光 PCR 检测复方 861 对 LX-2 细胞中活化及胶原合成和降解相关基因(包括α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶 1、2和组织基质金属蛋白酶抑制剂 1)mRNA 的影响 用复方 861 处理LX-2 细胞后,用TRIzol提取细胞总RNA,分光光度计定量,以oligo (dT)15 和M-MLV RT逆转录合成cDNA。采用美国Bio-Rad公司的iCycler iQ实时定量PCR系统对cDNA产物进行扩增和检测。同时绘制产物溶解曲线,以分析PCR产物是否存在非特异性扩增。2.3 明胶酶谱法检测复方 861 对 LX-2 细胞基质金属蛋白酶活性的影响 LX-2 细胞经复方 861 处理,收集上清,用明胶酶谱法测定 MMPs 酶活性。先通过 SDS-PAGE 电泳将样品中的蛋白分离。电泳结束后,将凝胶振荡洗脱,孵育,然后用考马斯亮兰染色,之后脱色,将胶图扫描,并进行分析处理。2.4 ELISA 法检测复方 861 对 LX-2 细胞组织基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP1)蛋白分泌的影响 LX-2 细胞经复方 861 处理,收集上清,用 TIMP1 ELISA 试剂盒,参照说明书步骤测定样品中 TIMP1 蛋白含量。3.结果:3.1 复方 861 对 LX-2 细胞增殖的影响 结果表明,复方 861 对 LX-2 细胞增殖的影响与药物剂量相关。在0.1mg·mL-1和 0.03mg·mL-1时,复方 861 可显著抑制LX-2 细胞的增殖,在药物处理 3 天后,细胞增殖都减少 15%。孵育后 5 天分别降低 25%和 21%,7 天后分别降低 35%和 18%。当浓度小于 0.01mg·mL-1时,复方 861 对LX-2 细胞的增殖无明显影响。3.2 复方 861 对 LX-2 细胞活化的影响 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肝星状细胞活化的标志。荧光定量 PCR 结果显示,复方 861 处理 24、48、72 小时,均可使 LX-2 中α-SMA mRNA 含量降低。<WP=6>- II - 复方 861 对人肝星状细胞作用机理的研究其中药物处理 48 和 72 小时,药物组与对照组有显著差异,p<0.05(48 小时)或 p<0.01(72 小时)。3.3 复方 861 对 LX-2 细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA 的影响 经复方 861 处理 24 小时,LX-2 细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA 含量无明显变化。但当药物处理超过 48 小时,复方 861 组 LX-2 细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA 含量明显降低,与对照组相比,有显著差异(p<0.05)。3.4 复方 861 对 LX-2 细胞中基质金属蛋白酶 1、2(MMP1、MMP2) mRNA 含量及蛋白酶活性的影响 经复方 861 处理 24、48、72 小时,LX-2 细胞中 MMP1 mRNA 含量显著提高。与之相比,经复方 861 处理 24 小时后, LX-2 细胞中 MMP2 mRNA 含量无明显变化;但当作用时间超过 48 小时后,复方 861 可以明显降低 LX-2 细胞中 MMP2 mRNA含量。凝胶酶谱结果显示,经复方 861 处理 24、48、72 小时,LX-2 细胞内基质金属蛋白酶的活性均显著提高。3.5 复方861对LX-2细胞中组织基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1) mRNA含量和蛋白分泌的影响 经复方 861 处理 24 小时,LX-2 细胞中 TIMP1 mRNA 及蛋白含量均无明显变化。但当处理时间超过 48 小时,复方 861 可使 LX-2 细胞中 TIMP1 mRNA 含量降低,其中处理 72 小时后,与对照相比,有显著差异(P<0.05)。经复方 861 处理 72 小时,LX-2 细胞分泌的 TIMP1 蛋白含量显著降低。4.结论:4.1 复方 861 可抑制 LX-2 细胞的增殖,其作用与剂量相关。4.2 经复方 861 处理 48 小时,LX-2 细胞中活化标志α-SMA mRNA 的水平显著降低,表明复方 861 可抑制 LX-2 细胞的活化。4.3 复方 861 可以显著降低 LX-2 中间质型胶原的合成,同时促进其降解,表现为间质胶原酶 MMP1 mRNA 含量明显升高;而Ⅰ、Ⅲ型胶原和 TIMP1 mRNA 和蛋白水平降低;此外,结果表明,药物对间质型胶原降解的促进作用出现在对该类成分合成的抑制作用之前。4.4 药物可以抑制 MMP2 mRNA 表达,提示该药还具有一定的保护正常基底膜的作用。4.5 药物除对 MMP1 mRNA 表达的提高作用是在 24 小时之外,对于其它基因和蛋白的调节作用均出现在 48 小时以后,尤其是对 TIMP1 的作用更是发生在 72 小时之后。这提示,药物对于这些基因和蛋白的调节作用可能是继发于该药物对细胞活化的抑制。4.6 实验结果还表明,复方 861 对 LX-2 细胞活化、以及胶原合成和降解的影响是独立于其对增殖的作用的,因为在相应的药物剂量时,细胞的增殖无明显变化。 本论文的创新之处在于: 1.本文以复方 861 的相关研究为载体,将荧光定量 PCR 等先?