论文部分内容阅读
目的：
探究柚皮苷（NRG）防治实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的疗效以及其通过STAT1通路和自噬调控小胶质细胞极化的作用。
方法：
分组与模型制作：本研究取C57BL/6雌性小鼠50只随机分成空白对照组、EAE模型组、NRG低、中、高剂量组，每组10只。空白对照组不做任何处理，其余各组建立EAE模型。
药物干预：造模成功后，免疫当日记作第0日。免疫后第1日开始，使用腹腔注射法分别给予NRG低、中、高剂量组NRG10、20、40mg/（kg·d），1次/日，连续10日；用相同方式给予空白对照组和EAE模型组小鼠等量生理盐水。
临床表现观察及神经功能障碍评分：从免疫当日开始，持续每日观察小鼠临床症状及使用改良Kono’5分法对各组小鼠进行神经功能障碍评分。EAE模型组及NRG各剂量组在发病高峰期处死，未发病及空白对照组小鼠饲养28日后处死。
指标检测：利用HE染色及LFB染色观察脊髓组织病理改变、免疫荧光染色法观察脊髓组织中小胶质细胞激活标志物Iba-1及自噬标志物LC3表达、Western blot法检测脊髓组织中STAT1、Beclin1、p62、LC3、CD16、CD206、iNOS及Arg-1蛋白水平、PT-PCR法检测脊髓组织中STAT1蛋白mRNA水平。
结果：
发病情况：空白对照组小鼠未发病，其余组小鼠均有不同程度发病。与EAE模型组比较，NRG各剂量组小鼠发病潜伏期延长（P＜0.01）、高峰期延迟（P＜0.01或P＜0.05）、高峰期神经功能障碍评分降低（P＜0.01或P＜0.05），NRG剂量越大，小鼠症状越轻。
小鼠脊髓组织HE染色：EAE模型组脊髓组织炎症细胞浸润较空白对照组明显，炎症评分增加（P＜0.01），而NRG各剂量组脊髓组织炎症细胞浸润较EAE模型组减少，炎症评分下降（P＜0.01），NRG剂量越大，效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
小鼠脊髓组织LFB染色：EAE模型组脊髓组织脱髓鞘区域较空白对照组明显增加，脱髓鞘评分增加（P＜0.01），而NRG各剂量组脊髓组织脱髓鞘区域较EAE模型组减少，脱髓鞘评分下降（P＜0.01），NRG剂量越大，效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
NRG减少小胶质细胞激活并促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞极化：与空白对照组比较，EAE模型组小鼠脊髓组织Iba-1表达增加，Iba-1阳性表达区域的平均OD值增加（P＜0.01），M1型小胶质细胞标记物iNOS及CD16表达明显增加（P＜0.01或P＜0.05），而M2型小胶质细胞标记物Arg-1及CD206表达明显减少（P＜0.01或P＜0.05）。与EAE模型组比较，NRG各剂量组小鼠脊髓组织Iba-1表达减少，Iba-1阳性表达区域平均OD值降低（P＜0.01），CD16及iNOS表达减少（P＜0.01），Arg-1及CD206表达增加（P＜0.01），且NRG剂量越大，变化越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
NRG下调了EAE中的STAT1通路：与空白对照组比较，EAE模型组小鼠脊髓组织中STAT1蛋白表达明显增加（P＜0.01），STAT1mRNA水平明显增高（P＜0.01或P＜0.05）。与EAE模型组比较，NRG各剂量组STAT1蛋白及mRNA表达均降低（P＜0.01），且NRG剂量越大，降低效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
NRG降低了EAE中的自噬：与空白对照组比较，EAE模型组小鼠脊髓组织LC3表达增加，LC3阳性表达区域的平均OD值增加（P＜0.01），LC3-II/LC3-I灰度值比值、Beclin1表达增加（P＜0.01），p62表达减少（P＜0.01）。与EAE模型组比较，NRG各剂量组LC3表达减少，LC3阳性表达区域的平均OD值降低（P＜0.01或P＜0.05），LC3-II/LC3-I灰度值比值、Beclin1表达减少（P＜0.01或P＜0.05），p62表达增加（P＜0.01），且NRG剂量越大，作用效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
结论：
NRG可减轻EAE小鼠发病症状及神经功能障碍评分，减少脊髓炎症细胞浸润及脱髓鞘程度，对EAE小鼠发病具有防治作用，且呈剂量依赖性。NRG对EAE小鼠发病的防治作用是通过调控EAE小鼠小胶质细胞极化、纠正M1/M2型小胶质细胞失衡而发挥。NRG通过下调STAT1通路和抑制自噬促使EAE中小胶质细胞由M1型向M2型极化。
探究柚皮苷（NRG）防治实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠的疗效以及其通过STAT1通路和自噬调控小胶质细胞极化的作用。
方法：
分组与模型制作：本研究取C57BL/6雌性小鼠50只随机分成空白对照组、EAE模型组、NRG低、中、高剂量组，每组10只。空白对照组不做任何处理，其余各组建立EAE模型。
药物干预：造模成功后，免疫当日记作第0日。免疫后第1日开始，使用腹腔注射法分别给予NRG低、中、高剂量组NRG10、20、40mg/（kg·d），1次/日，连续10日；用相同方式给予空白对照组和EAE模型组小鼠等量生理盐水。
临床表现观察及神经功能障碍评分：从免疫当日开始，持续每日观察小鼠临床症状及使用改良Kono’5分法对各组小鼠进行神经功能障碍评分。EAE模型组及NRG各剂量组在发病高峰期处死，未发病及空白对照组小鼠饲养28日后处死。
指标检测：利用HE染色及LFB染色观察脊髓组织病理改变、免疫荧光染色法观察脊髓组织中小胶质细胞激活标志物Iba-1及自噬标志物LC3表达、Western blot法检测脊髓组织中STAT1、Beclin1、p62、LC3、CD16、CD206、iNOS及Arg-1蛋白水平、PT-PCR法检测脊髓组织中STAT1蛋白mRNA水平。
结果：
发病情况：空白对照组小鼠未发病，其余组小鼠均有不同程度发病。与EAE模型组比较，NRG各剂量组小鼠发病潜伏期延长（P＜0.01）、高峰期延迟（P＜0.01或P＜0.05）、高峰期神经功能障碍评分降低（P＜0.01或P＜0.05），NRG剂量越大，小鼠症状越轻。
小鼠脊髓组织HE染色：EAE模型组脊髓组织炎症细胞浸润较空白对照组明显，炎症评分增加（P＜0.01），而NRG各剂量组脊髓组织炎症细胞浸润较EAE模型组减少，炎症评分下降（P＜0.01），NRG剂量越大，效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
小鼠脊髓组织LFB染色：EAE模型组脊髓组织脱髓鞘区域较空白对照组明显增加，脱髓鞘评分增加（P＜0.01），而NRG各剂量组脊髓组织脱髓鞘区域较EAE模型组减少，脱髓鞘评分下降（P＜0.01），NRG剂量越大，效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
NRG减少小胶质细胞激活并促进M1型小胶质细胞向M2型小胶质细胞极化：与空白对照组比较，EAE模型组小鼠脊髓组织Iba-1表达增加，Iba-1阳性表达区域的平均OD值增加（P＜0.01），M1型小胶质细胞标记物iNOS及CD16表达明显增加（P＜0.01或P＜0.05），而M2型小胶质细胞标记物Arg-1及CD206表达明显减少（P＜0.01或P＜0.05）。与EAE模型组比较，NRG各剂量组小鼠脊髓组织Iba-1表达减少，Iba-1阳性表达区域平均OD值降低（P＜0.01），CD16及iNOS表达减少（P＜0.01），Arg-1及CD206表达增加（P＜0.01），且NRG剂量越大，变化越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
NRG下调了EAE中的STAT1通路：与空白对照组比较，EAE模型组小鼠脊髓组织中STAT1蛋白表达明显增加（P＜0.01），STAT1mRNA水平明显增高（P＜0.01或P＜0.05）。与EAE模型组比较，NRG各剂量组STAT1蛋白及mRNA表达均降低（P＜0.01），且NRG剂量越大，降低效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
NRG降低了EAE中的自噬：与空白对照组比较，EAE模型组小鼠脊髓组织LC3表达增加，LC3阳性表达区域的平均OD值增加（P＜0.01），LC3-II/LC3-I灰度值比值、Beclin1表达增加（P＜0.01），p62表达减少（P＜0.01）。与EAE模型组比较，NRG各剂量组LC3表达减少，LC3阳性表达区域的平均OD值降低（P＜0.01或P＜0.05），LC3-II/LC3-I灰度值比值、Beclin1表达减少（P＜0.01或P＜0.05），p62表达增加（P＜0.01），且NRG剂量越大，作用效果越明显（P＜0.01或P＜0.05）。
结论：
NRG可减轻EAE小鼠发病症状及神经功能障碍评分，减少脊髓炎症细胞浸润及脱髓鞘程度，对EAE小鼠发病具有防治作用，且呈剂量依赖性。NRG对EAE小鼠发病的防治作用是通过调控EAE小鼠小胶质细胞极化、纠正M1/M2型小胶质细胞失衡而发挥。NRG通过下调STAT1通路和抑制自噬促使EAE中小胶质细胞由M1型向M2型极化。