由水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,简称Xoc)侵染水稻引起的水稻细菌性条斑病(Rice bacterial leaf streak,简称BLS)是危害水稻生产的一种重要植物细菌病害。该病害已成为继稻瘟病、白叶枯病、稻纹枯病后的又一大水稻病害,对中国和东南亚稻区的水稻造成严重危害。目前,有关细菌Xoc的致病机制尚缺乏全面深入的研究。鉴定Xoc的致病相关基因,解析不同基因的功能,对于揭示该病菌的致病机制具有重要意义。本研究利用转座子Tn5对水稻细菌性条斑病菌Xoc RS105进行转座子诱变,构建含有1500个菌株的突变体库。经过活体筛选,从1500个转座子插入突变体中获得2株致病性发生改变的突变体,编号分别为R-160和R-168。通过反向PCR方法扩增出两个突变体中转座子Tn5插入位点的侧翼序列,序列比对后发现突变体R-160和R-168中转座子Tn5分别插入到编码依赖于ATP的Clp蛋白酶ATP结合亚基基因clp X和亚精胺合成酶的编码基因spe E中。在此基础上,通过同源重组分别从Xoc RS105中敲除clp X和spe E基因获得基因敲除菌株Δclp X和Δspe E。分别测定上述2个基因敲除菌株对于水稻的致病性,结果显示上述两个基因敲除后,菌株Δclp X和Δspe E较野生型菌株Xoc RS105的致病能力降低,分别于突变体R-160和R-168的致病能力类似。表明基因clp X和spe E属于水稻细菌性条斑病菌Xoc RS105的致病相关基因。ClpX属于Hsp100蛋白家族,是细胞内蛋白质量控制系统的一种组分,在多种生物细胞中发挥识别和降解异常蛋白从而维持细胞内环境稳定的功能。为了揭示Xoc中ClpX在致病性中的可能作用,分别构建了clp X基因敲除菌株的互补菌株Δclp X::clp X和大肠杆菌(Escherichia coli)clp X基因的异源互补菌株Δclp X::clp XEc,测定了野生型Xoc RS105和上述菌株的致病性相关表型,结果显示,clp X缺失后,致病能力降低,运动能力变弱,产胞外蛋白酶能力减弱25%,产胞外多糖能力减弱20%,在多种营养条件下生长能力也明显变弱,在抗胁迫方面的比较,Δclp X对铜离子、银离子、钴离子、氨苄青霉素、红霉素、链霉素、万古霉素、壮观霉素、过氧化氢、维生素K3、杆菌肽、SDS敏感,这说明clp X基因在Xoc中对抗胁迫方面存在着一定的影响,在定殖实验中,Δclp X在水稻叶片内定殖能力下降,细菌本身clp X基因和来自E.coli的clp X基因异源互补后,表型均能恢复,表明clp X基因对于Xoc在环境适应中发挥重要的作用。为了分析spe E基因的功能及其在致病性中的作用,采用高效液相色谱HPLC方法测定了spe E敲除菌株Δspe E及其野生型Xoc RS105稳定期生长阶段细胞内亚精胺的含量,结果显示spe E基因缺失后,细胞内亚精胺含量显著低于其在野生型Xoc RS105中的含量,表明基因spe E参与亚精胺的合成过程。在此基础上,构建了spe E缺失菌株的互补菌株Δspe E::spe E,测定了Xoc RS105、Δspe E及其互补菌株Δspe E::spe E的运动性、生长、胞外蛋白酶产生能力等致病性相关表型,结果显示,spe E缺失后,致病能力降低,运动能力增强,对热环境的抵抗能力变弱,对抗胁迫压力方面表现出红霉素、链霉素、万古霉素、维生素K3、Triton X-100敏感,这说明spe E基因在Xoc中对抗生素、金属离子、氧化物等方面胁迫存在着一定的影响,在定殖实验中,Δspe E在水稻叶片内定殖能力下降,上述表型经spe E基因互补后均能恢复。亚精胺作为多胺的一种,在真核和原核细胞中普遍存在,调控生物的逆境适应过程。本研究暗示Xoc细菌中spe E基因通过参与亚精胺的合成来调节该细菌的环境适应和致病性。