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本论文包括三部分内容:一、对猫人参(大籽猕猴桃 Actinidia macrosperma C.F.Liang)中具有淋巴细胞增殖活性的多糖成分进行了研究;二、对猫人参抑制肿瘤细胞活性部位的化学成分进行了研究;三、对猫人参四个不同极性部位及通过分离纯化得到的均-多糖和小分子化合物进行了体外活性筛选。
第一部分内容包括:对猫人参多糖成分的研究采用沸水提取,95%乙醇沉淀,透析除去小分子化合物,最后冷冻干燥得到猫人参粗多糖。猫人参粗多糖经 DEAE Sepharose Fast Flow 凝胶柱层析分成四个具有不同电荷性质的多糖部位,用HPGPC法测定其分子量分布后选用合适的分子筛凝胶柱层析,最后分离得到二个均一多糖 AMP-Ⅲ-1和AMP-Ⅳ-1,均为首次从该植物中分离得到。并通过各种化学方法(糖组成分析,糖残基连接方式分析,部分酸水解等)、光谱学方法(NMR,GC-MS,IR等)和物理化学方法(分子量测定)对均一多糖AMP-Ⅲ-1,AMP-Ⅳ-1的一级结构进行了鉴定。根据实验结果对多糖AMP-Ⅲ-1和AMP-Ⅳ-1的可能结构进行了讨论。
HPGPC法测定了两个均一多糖的分子量,AMP-Ⅲ-1分子量为8.1×10<4>道尔顿,AMP-Ⅳ-1分子量为5.6×10<4>道尔顿。通过糖组成分析确定AMP-Ⅲ-1是由Rha、Fuc、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal、ManA、GlcA、GalA以摩尔比为1.0:2.6:4.1:2.3:3.6:1.6:10.3:4.2:5.9:10.9组成的酸性杂多糖。AMP-Ⅳ-1是由Rha、Fuc、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal、ManA、GlcA、GalA以摩尔比为1.3:2.5:2.0:1.0:2.5:1.0:9.0:7.2:10.3:11.3组成的酸性杂多糖。通过甲基化后糖残基连接方式分析确定多糖AMP-Ⅲ-1主链由1,2-连接的葡萄糖残基,1,4-连接的甘露糖残基及1,2,3-连接的葡萄糖残基组成。侧链中检测到阿拉伯糖-1,4-半乳聚糖,另外可能含有鼠李半乳聚糖。多糖AMP-Ⅳ-1中主要含有1,4-连接的半乳糖残基,1,2-连接的半乳糖残基,1,3,4-连接的葡萄糖残基,1,2-连接的甘露糖残基,末端半乳糖残基。并根据已有文献对.AMP-Ⅲ-1,AMP-Ⅳ-1的<13>C NMR数据进行了归属。
第二部分内容包括:对猫人参活性部位中小分子化学成分进行了研究,利用正相和反相硅胶及Sephadex LH-20等色谱技术反复分离纯化,MS、NMR等波谱学方法和化学方法进行结构鉴定。从猫人参乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分得到11个化合物,鉴定结构10个,其结构分别鉴定为: niga-ichigoside F1(化合物AM-10),isotachioside(化合物 AM-9),meamsitrin(化合物 AM-8),2α,3α,24-三羟基-12烯-齐墩果烷(12-oleanene-2α,3α,24-triol,化合物.AM-7),积雪草酸(asiatic acid,化合物 AM-6),表儿茶素(epicatechin,化合物 AM-5),儿茶素(catechin,化合物 AM-4),熊果酸(ursolic acid,化合物 AM-3),胡萝卜苷(β-daucosteorl,化合物AM-2),β-谷甾醇(β-sitosterol,化合物AM-1)。其中化合物AM-10、AM-7、AM-6和.AM-3为三萜类化合物,AM-8、AM-5、AM-4为黄酮类化合物,AM-2、AM-1为甾醇类化合物,AM-9为酚苷类化合物。以上化合物均为从该植物中首次获得,其中化合物 AM-7,AM-8,AM-9,AM-10为首次从猕猴桃属植物中分离得到。
第三部分内容包括:对猫人参四个不同极性部位及通过分离纯化得到的均一多糖和小分子化合物进行了体外活性筛选。四个不同极性Am-1、Am-2、Am-3、Am-4对所测试的4个不同组织来源的肿瘤细胞株(P388*,A-549,Hep6,bgc-823)敏感性有所不同,抑制率有一定差别。Am-1,Am-2,Am-3,Am-4四者均显示出一定的抑制P388*,A-549肿瘤细胞生长活性, Am-2,Am-3的对于该两种细胞抑制率显著于 Am-1,Am-4。另外Am-2,Am-3还具有显著抑制bgc-823肿瘤细胞生长的活性。故确定 Am-2,Am-3(即乙醇提取乙酸乙酯萃取段,正定醇萃取段)为猫人参抑制肿瘤细胞增殖的有效部位。
将Am-2部位进行分离纯化得到的化合物AM-6,AM-7,AM-9,AM-8,AM-4与AM-5的混合物进行抑制肿瘤细胞活性筛选。结果表明化合物AM-6,AM-7,AM-8,AM-9对MCF-7乳腺癌细胞生长抑制作用较强,高剂量组和低剂量组细胞抑制率与空白对照组相比,均有非常显著性差异(P<0.001),高剂量组与阳性对照组相比无显著性差异,且剂量与肿瘤细胞的生长抑制程度呈正相关,即随着浓度大增加,抑制率增大。化合物AM-6, AM-8对HO-8910卵巢癌细胞生长抑制作用也较显著,高剂量组与阳性对照相比无显著性差异,剂量与肿瘤细胞的生长抑制程度呈正相关,与空白对照组相比,均有显著差异(P<0.01),其中AM-8高剂量组与空白组差异更显著(P<0.001)。从猫人参粗多糖中分离得到的四个具有不同电荷性质的多糖部位AMP-Ⅰ,AMP-Ⅱ,AMP-Ⅲ,AMP-Ⅳ经过B淋巴细胞和T淋巴细胞增殖活性筛选,结果表明AMP-Ⅰ,AMP-Ⅱ,AMP-Ⅲ,AMP-Ⅳ对丝裂原ConA诱导的正常小鼠T淋巴细胞增殖活性无明显影响,各对丝裂原LPS诱导的正常小鼠B淋巴细胞有一定增强增殖活性的作用。AMP-Ⅲ,AMP-Ⅳ反复纯化后得到的均一多糖AMP-Ⅲ-1和AMP-Ⅳ-1对于 B 淋巴细胞增殖活性的增强较纯化前AMP-Ⅲ和AMP-Ⅳ显著。