目的:代谢性酸中毒是与一系列临床疾病相关的病理生理改变,患者常表现为深大呼吸、恶心、呕吐等,引起心血管系统、呼吸系统、胃肠道系统、中枢神经系统受损,以及全身皮肤干燥及破损等,与患者的预后密切相关,与低体温、凝血障碍并称为“死亡三角”。糖尿病是一种高发的基础代谢性疾病,常并发代谢性酸中毒。糖尿病患者会出现皮肤感染、难以愈合的症状,当病情加重发生酸中毒时,皮肤损伤情况进一步恶化,形成恶性循环,治疗不及时可能引起溃烂、坏疽甚至截肢。因此探究代谢性酸中毒造成皮肤损伤的具体机制具有重要意义。组织酸中毒主要体现为疼痛和炎症反应,瞬时感受器电位通道（TRP）对这两种反应具有重要调节作用。瞬时感受器电位香草素受体亚家族（Transient receptor potential vanilloid,TRPV）是TRP的家族成员之一。哺乳动物TRPV由TRPV1-6构成,TRPV3主要表达于人体皮肤组织细胞,介导皮肤感觉、影响表皮角质细胞增殖分化、毛发生长,参与炎症反应,对皮肤内稳态维持和正常功能具有重要调节作用。该离子通道受到温度、渗透压、p H值以及胞内信号分子等多种因素调节。在组织酸中毒中,表达TRPV3的细胞不可避免的暴露于酸性p H条件下,因此研究酸对TRPV3通道的调控作用具有非常重要的意义。p H较低时,环境中存在多余的质子（H+）,将诱导蛋白质内部氨基酸获得质子,即发生质子化修饰。通常,质子通过改变谷氨酸（E）,天冬氨酸（D）或组氨酸（H）残基的构象来调节蛋白质功能。以往研究认为,酸能通过胞内S2和S3跨膜螺旋部分激活TRPV3通道,且能通过调控非选择性TRPV通道激动剂2-APB的构象来增强其配体活性,进而激活TRPV3通道。但质子对TRPV3通道的具体影响,以及通过哪些质子化残基发挥功能,尚有待于进一步探究。为了探明TRPV3是否参与代谢性酸中毒皮肤损伤,除阐明质子调控TRPV3通道的作用外,还需在代谢性酸中毒皮肤损伤模型中检测TRPV3的表达变化以及其可能触发的皮肤损伤相关信号通路,并阐明TRPV3特异性抑制剂对代谢性酸中毒皮肤损伤的治疗作用,这将有助于揭示包括代谢性酸中毒在内的多种皮肤性疾病的形成机制及治疗靶点。研究方法:一、验证质子对TRPV3通道可质子化残基的具体作用1.通过定点突变验证参与TRPV3功能质子调节的质子化残基。2.通过荧光指示剂Fluo-4/AM测定细胞内Ca2+水平。3.通过全细胞膜片钳技术记录TRPV3电流。4.通过分子动力学模拟分析E682,E689和D727定点突变对TRPV3的C末端结构和自由能分布的作用。二、验证酸中毒对大鼠皮肤损伤模型中TRPV3的作用机制以及连翘脂苷B对大鼠皮损的治疗作用1.通过饲喂含NH4Cl的饮水建立代谢性酸中毒大鼠模型,通过涂抹乳酸和咪喹莫特乳膏建立皮肤损伤模型,并给予或不给予连翘脂苷B进行治疗。2.通过HE染色检测皮肤组织病理变化。3.通过Real-time PCR及Western blot检测TRPV3 mRNA和蛋白表达。4.通过ELISA检测皮肤组织中TGF-α水平。5.通过Western blot检测EGFR、p-EGFR蛋白的表达。结果:一、可质子化残基参与TRPV3通道的抑制和敏化1.细胞外质子通过选择性过滤器中的天冬氨酸残基（D641）抑制激动剂诱导的TRPV3激活。2.细胞内质子则通过细胞质C端谷氨酸和天冬氨酸残基（E682,E689和D727）使通道敏化。3.三个C端残基的中和作用使通道对激动剂的刺激提前敏感。4.三个C端残基的电荷中和作用稳定了敏化通道构象,提高了S6跨膜段和TRP结构域之间的连接子中α-螺旋形成的概率。二、TRPV3在代谢性酸中毒大鼠皮肤损伤模型中的作用机制以及连翘脂苷B的治疗作用1.观察结果显示,乳酸处理及咪喹莫特处理能明显诱导皮肤损伤症状,二者联用最为严重,代谢性酸中毒大鼠的皮肤损伤要高于正常大鼠。2.皮肤组织HE染色显示乳酸处理及咪喹莫特处理能明显诱导皮肤损伤病理表现,如:角质较少或增厚、炎症等。二者联用损伤最为严重,代谢性酸中毒大鼠的损伤程度要高于正常大鼠。3.Real-time PCR及Western blot结果显示,代谢性酸中毒大鼠皮肤的TRPV3 mRNA及蛋白表达显著高于正常大鼠;乳酸及咪喹莫特处理能显著上调正常大鼠及酸中毒大鼠皮肤TRPV3 mRNA及蛋白表达,其中代谢性酸中毒组两药联用时TRPV3 mRNA及蛋白表达要高于其他组别。4.ELISA结果显示,代谢性酸中毒大鼠皮肤匀浆TGF-α水平显著高于正常大鼠;而在正常大鼠中及酸中毒大鼠中,乳酸及咪喹莫特处理均能显著上调TGF-α水平,且代谢性酸中毒组+两药联用TGF-α水平要高于其他组别。5.Western blot结果显示,代谢性酸中毒大鼠的p-EGFR蛋白水平显著高于正常大鼠,而EGFR蛋白变化不具有显著性;在正常大鼠中,咪喹莫特处理能显著上调p-EGFR、EGFR蛋白水平,乳酸及咪喹莫特共同作用组的p-EGFR、EGFR蛋白水平要高于其他组别。在代谢性酸中毒大鼠中,乳酸及咪喹莫特处理均能显著上调p-EGFR、EGFR蛋白水平,且代谢性酸中毒+乳酸+咪喹莫特组的p-EGFR、EGFR蛋白水平要高于其他组别。6.观察结果显示连翘脂苷B能有效改善正常大鼠皮肤损伤模型及代谢性酸中毒皮肤损伤模型大鼠的皮肤损伤症状。7.HE染色结果显示连翘脂苷B能有效缓解正常大鼠皮肤损伤模型及代谢性酸中毒皮肤损伤模型大鼠的皮肤损伤组织病变。8.Real-time PCR及Western blot结果显示连翘脂苷B能显著影响正常大鼠皮肤损伤模型及代谢性酸中毒皮肤损伤大鼠的TRPV3 mRNA及蛋白的表达。9.ELISA结果显示连翘脂苷B能显著下调正常大鼠皮肤损伤模型及代谢性酸中毒皮肤损伤模型的TGF-α水平。10.Western blot结果显示连翘脂苷B能显著下调正常大鼠皮肤损伤模型及代谢性酸中毒皮肤损伤模型的p-EGFR、EGFR蛋白水平。结论:质子通过作用于TRPV3通道胞外侧选择筛来抑制TRPV3功能,通过对该通道胞内侧作用来促进关闭态通道从天然的非敏化态向敏化构型转化。这种TRPV3质子感受新机制为TRPV3在表皮屏障通透性的调节和在组织酸中毒情况下皮肤病变中所扮演的角色提供了新见解。在代谢性酸中毒皮肤损伤模型中,TRPV3表达显著上调,且TRPV3可能通过激活TGF-α/EGFR信号促进皮肤损伤。而TRPV3特异性抑制剂连翘脂苷B能下调皮肤损伤组织TRPV3 mRNA及蛋白表达,并阻断TGF-α/EGFR信号,最终改善代谢性酸中毒皮肤损伤状况及病理变化。