论文部分内容阅读
玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,CMV)与玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)、小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)或甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)复合侵染玉米,引起严重的玉米致死性坏死病(Corn lethal necrosis disease,CLND)。本文调查了 MCMV及CLND在中国的分布情况,中国发生的CLND是由MCMV与SCMV复合侵染引起,目前仅在我国云南和四川两省有MCMV及CLND的发生。利用分离纯化的MCMV病毒粒子,制备了可以特异识别MCMV的单克隆抗体和多克隆抗体,并据此建立了可以高效检测MCMV的血清学检测方法,为快速检测MCMV提供了可靠的技术手段。对云南和四川MCMV分离物的全长基因组进行了 cDNA克隆及测序,全长cDNA序列分析表明在中国发生的MCMV与最早在美国等地发生的MCMCV同源性在96%-97%,系统进化树分析表明中国的MCMV分离物与美国分离物分别归属于两个不同的组。根据CP序列进行的分析表明,中国分离物与最近几年内报道发生的泰国分离物及东非几个国家的分离物同源性均在99%以上。利用中国云南分离物YN2的全长cDNA,构建了基于农杆菌双元载体的侵染性克隆pMCMV,用农杆菌注射接种可以高效地侵染玉米,pMCMV接种后引起的系统性病毒症状与野生型病毒粒子摩擦接种所引起的病毒症状没有差异,病毒粒子的相对积累量也没有显著差别。pMCMV接种并产生系统病毒侵染的玉米叶片粗汁液中可以观察到与野生型病毒一致的球形病毒粒子,利用粗汁液摩擦接种健康的玉米幼苗也可以形成系统性侵染。MCMV与SCMV复合侵染(MS)比MCMV单独侵染在玉米上引起更为严重的症状。我们比较了 MCMV单独侵染和MS复合侵染在转录组和细胞学水平的差异。在转录组水平,复合侵染比MCMV单独侵染引起更多的基因差异表达,MCMV单独侵染引起2916个基因表达变化,而复合侵染引起7247个基因差异表达。在这些差异表达基因中,与植物防卸反应相关的基因,如与羟脂(如茉莉酸类物质,JAs)合成、水杨酸合成及生长素合成相关的很多基因,都出现了较为显著的变化。使用透射电子显微镜比较了 MCMV单独侵染和MCMV与SCMV复合侵染引起的细胞病理变化,复合侵染引起细胞学层面更为严重的破坏,最明显的是叶绿体和线粒体的变化。相对于MCMV单独侵染或健康植株,复合侵染植株在维管束鞘细胞叶绿体中积累的淀粉粒变小,光合作用受到影响;线粒体破坏更为严重,呼吸作用也受影响。光合作用与呼吸作用都是植物体内的能量供应系统,二者同时受到影响对植物来说可能是致命的,复合侵染中这两种变化可能是导致其产生系统性坏死的直接原因。在电子显微镜下,观察到了在MCMV或MS组中都出现了类似于番茄丛矮病毒(Tomato bushystunt virus,TBSV)侵染植物时形成的过氧化物多泡体(pMVBs)。通过共聚焦显微镜,发现MCMV编码的与复制相关的p50和p111均定位于过氧化物酶体,通过酵母双杂交实验发现p50和p111可以直接相互作用,这暗示着MCMV侵染形成的pMVBs是其复制位点或是复制机器装配的场所,而p50与p111共同参与到pMVBs的形成过程中。通过跨膜分析与缺失突变实验,发现p50与TBSV的复制辅助酶p33类似,包含2个跨膜区,跨膜区对于p50定位于过氧化物酶体至关重要。