乳腺癌的高发病率严重影响我国妇女的身心健康,而早发现并及时治疗可以降低其带来的死亡率。研究表明,基因启动子区域是否存在被甲基化,可以成为早期筛查乳腺癌的重要生物学指标。随着“液态活检”技术的快速发展,发现监测游离DNA的甲基化水平对肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。因此,本文建立了一种一体化评估乳腺癌患者血清样本中DNA甲基化的方法,为乳腺癌早期诊断提供新思路。1、针对血清样本,优化了一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒,包括磁珠用量,核酸助沉剂的量等,并进行了一系列性能测试,如试剂盒的稳定性测试和回收率测试。结果显示,该试剂盒稳定性好,其核酸的回收率也在90%以上。同时,其对真实样本有着相同甚至更优于商用柱式法试剂盒的提取效果。最后,实验还优化了该试剂盒的提取步骤,合并了裂解和结合步骤,大大的缩短了核酸提取时间。2、建立了一种重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)荧光检测SNRPN基因甲基化的新方法。实验主要包括筛选RAA荧光检测方法所需的引物与探针,并经过一系列优化,包括反应时间和反应温度,最终得到了最优的体系。然后,通过合成了一段标准的甲基化模板,用于甲基化基因定量曲线的绘制。实验结果表明,当甲基化模板的浓度在4.64×10~8 copies/μL-4.64×10~4 copies/μL,其具有相关性(R~2>0.95)。因此,初步建立的RAA荧光检测方法可以对SNRPN基因的甲基化情况实行定量评估。3、结合优化的核酸提取试剂盒与建立的甲基化检测方法,应用于对乳腺癌血清样本中RASSF1A基因甲基化的筛查。利用优化的磁珠法核酸提取试剂盒对25例乳腺癌血清样本进行处理,将得到的核酸分两批处理,一部分用MSP方法进行检测,另一部分用RAA荧光方法进行检测,检测结果如下:MSP方法的检测率是52%(13/25),RAA荧光方法的检出率是56%(14/25),两者的差异来源于其中一个样本中的甲基化模板浓度过低,导致MSP方法不能检出。实验结果表明,建立的RAA荧光检测方法基本符合甲基化基因筛查的需求,较MSP方法有更高的灵敏度。