研究背景与目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染与胃癌的发生发展密切相关,被WHO定为胃癌的一类致癌物,但其确切的致病机制仍不清楚。肿瘤细胞主要通过糖酵解产生能量,然后在细胞质中将葡萄糖发酵成乳酸,这被称为“Warburg效应”。胃癌也具有Warburg效应,与胃癌的发生、侵袭、转移、耐药及预后不良密切相关。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）作为有氧糖酵解过程中的关键酶,参与糖酵解途径促进肿瘤的侵袭和转移。H.pylori感染后胃上皮细胞糖酵解增加,而且我们前期的转录组结果显示H.pylori感染能上调胃上皮细胞PGK1的表达,提示H.pylori感染可能通过上调胃上皮细胞PGK1的表达增加糖酵解参与其致病致癌过程。但是,H.pylori通过何机制引起上述改变却不清楚。线粒体是细胞能量代谢的主要场所,线粒体裂变/融合的平衡维持线粒体的稳态,线粒体裂变可促进线粒体自噬,减少氧化磷酸化（OXPHOS）,上调有氧糖酵解,进而促进肿瘤的发生发展。线粒体活性氧（ROS）可触发线粒体自噬,黑素细胞诱导转录因子（MITF）在线粒体自噬过程中也发挥重要作用,并通过控制自噬-溶酶体系统进行糖酵解。H.pylori感染可促进胃上皮细胞内ROS和线粒体ROS的生成,那么,H.pylori感染是否通过诱导线粒体ROS调控线粒体自噬,目前尚未见报道。MITF在胃癌中高表达,并参与胃癌细胞的增殖、迁移和凋亡的调控,那么,作为胃癌的重要致病因子H.pylori是否参与了这一过程?MITF的高表达是否通过诱导线粒体自噬导致疾病发生?目前均不清楚。p53是一经典的肿瘤抑制因子,它除了调控细胞增殖、凋亡和细胞周期外,还参与了线粒体呼吸、代谢、自噬、mt DNA修复和ROS生成的调控。p53可抑制线粒体ROS生成和线粒体自噬,同时p53还可下调PGK1表达,抑制糖酵解。H.pylori感染能下调胃上皮细胞中p53的表达,抑制p53抗肿瘤功能,促进细胞增殖,那么,H.pylori感染抑制p53的表达,可否影响胃上皮细胞的线粒体自噬及糖酵解目前尚不清楚。基于以上研究现状,本文进行了以下几方面的研究:（1）H.pylori感染对线粒体自噬的影响,及MITF在其中的作用;（2）分析了H.pylori感染对PGK1的调控作用及作用机制;（3）分析了p53和线粒体ROS与PGK1及线粒体自噬的关系;（4）PGK1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响。以期从p53对线粒体自噬及PGK1的调控这一新的角度探究幽门螺杆菌感染致病致癌机制。材料与方法:（一）H.pylori通过ROS和MITF调控胃上皮细胞的线粒体自噬1.H.pylori感染对线粒体形态和线粒体自噬的影响:构建H.pylori感染AGS细胞及BGC823细胞的模型,用激光共聚焦显微镜分析胃上皮细胞的线粒体膜电位及线粒体形态,高内涵细胞成像分析系统检测胃上皮细胞线粒体ROS（Mito SOX）的表达,透射电子显微镜观察胃上皮细胞的线粒体形态,用激光共聚焦显微镜分析线粒体荧光探针（Mito Tracker）和自噬标志物LC3B的定位,用线粒体自噬PCR array试剂盒筛选出与线粒体自噬相关的基因,用western blot检测细胞中线粒体融合蛋白（MFN1、MFN2）、MITF和线粒体中自噬标志物（p62、LC3Ⅱ）的蛋白表达。2.ROS对线粒体自噬的调控:在构建好的H.pylori感染及NAC（ROS抑制剂）处理小鼠模型中,用免疫组织化学法检测小鼠胃组织中MFN1、MFN2、MITF的表达。NAC处理胃上皮细胞后,高内涵细胞成像分析系统检测Mito SOX的表达,用western blot检测胃癌线粒体中p62和LC3Ⅱ的表达。3.MITF对胃上皮细胞线粒体自噬的调控:用si RNA构建敲减MITF基因的胃上皮细胞,通过western-blot检测线粒体中MITF、p62和LC3Ⅱ的蛋白表达。（二）H.pylori感染的胃上皮细胞和胃黏膜病变过程中PGK1的表达1.PGK1在胃癌中的表达及可能参与的生物学过程:收集24例临床胃癌患者手术后胃癌及癌旁组织标本,采用q PCR、western blot及免疫组织化学检测PGK1的表达。用TIMER肿瘤数据库分析了PGK1在各种肿瘤中的表达;通过生物信息学分析PGK1在胃癌中可能参与的生物学过程。2.PGK1在不同胃黏膜病变阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:收集不同病变阶段:轻/重度慢性非萎缩性胃炎（M/SNAG）萎缩性胃炎（AG）、肠化生（IM）、异型增生（Dys）和胃癌（GC）临床患者胃黏膜,免疫组织化学染色检测PGK1的表达。3.H.pylori对不同PGK1表达的胃上皮细胞中PGK1表达的影响:通过慢病毒构建PGK1低表达及过表达的稳转细胞株和NC细胞,建立H.pylori与胃上细胞共培养模型,采用q PCR和western blot检测胃上皮细胞中PGK1的表达。（三）p53通过调控MITF/PGK1影响胃上皮细胞的线粒体自噬和糖酵解1.H.pylori感染通过PGK1影响胃上皮细胞的糖酵解:H.pylori 7.13感染PGK1低表达及过表达的稳转细胞株,采用q PCR和western blot检测细胞PGK1的表达,Seahorse XF24通量分析仪测量细胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）,同时检测细胞乳酸水平,通过激光共聚焦显微镜观察PGK1与线粒体的共定位,western blot检测线粒体中PGK1的表达。2.H.pylori感染胃上皮细胞内p53、MTIF和PGK1之间的相互作用:H.pylori感染过表达p53基因及敲减MITF基因的胃上皮细胞,高内涵细胞成像分析系统检测Mito SOX的表达,western blot和q PCR检测PGK1、p53、MITF、p62和LC3Ⅱ的表达,同时检测胃上皮细胞中乳酸的表达。免疫组织化学检测NAC处理后的小鼠胃黏膜组织中PGK1的表达。COIP检测细胞中的p53、MITF、PGK1蛋白的相互作用。（四）H.pylori感染调控PGK1影响胃上皮细胞的生物学过程H.pylori感染PGK1基因过表达和敲减的AGS和BGC823稳转细胞,通过体外克隆形成实验、Ed U细胞增殖法及CCK8检测细胞的增殖情况;通过Transwell细胞侵袭实验检测细胞的侵袭能力;通过划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测细胞的迁移能力。（五）H.pylori感染通过PGK1影响胃上皮细胞的转录水平用H.pylori 7.13感染NC-AGS和PGK1lowAGS,然后将样本送至上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组学分析。分析方法:（1）通过主成分分析对转录组样本进行分析;（2）用DESeq2分析软件分析差异基因,筛选标准:差异倍数（Fold Change）＞1.5,校正P＜0.05;（3）对差异基因进行GO和KEGG富集分析。结果:（一）H.pylori通过ROS和MITF调控胃上皮细胞的线粒体自噬1.H.pylori感染诱导线粒体膜去极化和线粒体分裂:H.pylori感染后,细胞的线粒体的膜电位的下降或丧失,线粒体广泛破碎。H.pylori感染胃上皮细胞中MFN1、MFN2蛋白表达显著低于未感染组（P＜0.05）,且呈浓度依赖性。H.pylori感染小鼠胃粘膜内MFN1、MFN2的表达也显著低于未感染组（P＜0.05）。2.H.pylori通过ROS调控胃上皮细胞的线粒体自噬:H.pylori感染的胃上皮细胞内Mito SOX的表达升高（P＜0.05）,LC3B与Mito Tracker的共定位增加。透射电子显微镜显示H.pylori感染的胃上皮细胞线粒体表现出退化性变化,线粒体嵴膜缺失和基质肿胀,而且在自噬体内可以看到异常线粒体,线粒体中LC3Ⅱ和p62的蛋白表达增加。NAC处理后,细胞中Mito SOX的表达降低,线粒体中p62和LC3Ⅱ的蛋白表达降低。3.筛选线粒体自噬关键基因并在体内外验证:通过PCR array检测发现H.pylori感染胃上皮细胞后促进自噬的基因MITF、ATF4、ATG13、JUN、BNIP3等基因表达上调,抑制自噬的基因MFN1和促进自噬的基因（AKT1、RHOT2）表达下调。选择MITF进行验证,结果表明H.pylori感染的胃上皮细胞可显著上调MITF蛋白的表达（P＜0.05）,且呈时间和浓度依赖性,H.pylori感染组小鼠胃粘膜组织中MITF的表达也显著高于未感染组（P＜0.05）。4.H.pylori通过ROS调控MITF诱导胃上皮细胞线粒体自噬:NAC处理后,小鼠胃黏膜组织中MITF的表达降低,而且NAC处理能抑制H.pylori感染引起的MITF表达的升高（P＜0.05）。敲减MITF基因后,线粒体中MITF、p62和LC3BⅡ的蛋白表达降低。（二）H.pylori感染的胃上皮细胞和胃黏膜病变过程中PGK1的表达1.PGK1在胃癌中的表达及可能参与的生物学过程:胃癌组织中PGK1的表达显著高于癌旁组织（P＜0.05）。生物信息学分析表明,PGK1可能通过p53信号通路、细胞周期、DNA复制、磷酸戊糖途径、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、糖酵解途径、VEGFA-VEGFR2信号通路和细胞周期等通路在胃癌中发挥作用。2.PGK1在不同胃黏膜病变阶段中的表达:AG、IM、Dys、GC中PGK1的表达显著高于MNAG（P＜0.01）,且随着胃黏膜病变的加剧（AG→IM→Dys→GC）,PGK1的表达逐渐增加,在胃癌中的表达最高（P＜0.05）。3.PGK1与H.pylori感染的关系:在MNAG、SNAG、Dys、GC组中,H.pylori感染组PGK1的表达显著高于未感染组（P＜0.05）,在AG、IM组中,H.pylori感染组与未感染组差异无统计学意义（P＞0.05）。H.pylori感染小鼠胃粘膜中PGK1的表达显著高于未感染组（P＜0.05）。无论是在PGK1过表达、敲减还是WT型胃上皮细胞,H.pylori感染可显著上调PGK1和表达（P＜0.05）。（三）p53通过调控MITF/PGK1影响胃上皮细胞的线粒体自噬和糖酵解1.H.pylori感染诱导PGK1线粒体移位促进细胞糖酵解:H.pylori感染胃上皮细胞线粒体中PGK1蛋白表达显著上调,且PGK1与Mito Tracker线粒体的共定位明显增多。H.pylori感染的胃上皮细胞中OCR值显著降低,ECAR值显著升高,乳酸水平显著升高（P＜0.05）,敲减PGK1后可部分逆转上述改变（P＜0.05）,而过表达PGK1后细胞内的乳酸水平升高更显著（P＜0.05）。2.H.pylori感染过程中p53和ROS可相互调控:ROS抑制剂NAC处理胃上皮细胞后p53表达显著升高（P＜0.05）;无论有无H.pylori感染,p53基因过表达均可显著降低胃上皮细胞内Mito SOX的表达降低（P＜0.05）,表明在H.pylori感染过程中p53和ROS可相互调控。3.H.pylori感染通过p53调控MITF诱导的线粒体自噬:COIP检测发现MITF与p53有相互作用。胃上皮细胞线粒体中p53蛋白的表达与MITF的表达呈负相关。H.pylori感染可抑制P53蛋白的表达,同时增加WT型和p53基因过表达胃上皮细胞内MITF、p62和LC3BⅡ的蛋白表达,p53基因过表达可部分逆转这些改变。4.H.pylori感染通过MITF影响PGK1的表达:COIP检测发现MITF与PGK1有相互作用,无论有无H.pylori感染,敲减MITF基因后,胃上皮细胞内PGK1的表达均降低。5.p53和ROS调控PGK1影响胃上皮细胞内乳酸水平:在动物模型中,无论有无H.pylori感染,NAC处理均可显著降低小鼠胃粘膜中PGK1的表达（P＜0.05）。在细胞水平,NAC处理也同样可降低H.pylori感染和未感染的胃上皮细胞中PGK1蛋白的表达。COIP检测发现胃上皮细胞内PGK1与p53有相互作用;过表达p53能抑制胃上皮细胞内PGK1蛋白的表达;在WT和p53过表达的胃上皮细胞H.pylori感染均可显著增加细胞内乳酸水平（P＜0.01）,p53过表达可部分逆转这一变化（P＜0.05）。（四）H.pylori感染调控PGK1影响胃上皮细胞的生物学过程H.pylori感染NC细胞、PGK1基因过表达和敲减的胃上皮细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于未感染细胞（P＜0.05）;无论有无H.pylori感染PGK1基因过表达胃上皮细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于NC细胞（P＜0.05）,而PGK1基因敲减的细胞则反之（P＜0.05）。（五）H.pylori感染通过PGK1影响胃上皮细胞的转录水平1.PGK1对胃上皮细胞转录水平的影响在NC-PGK1lowAGS和PGK1lowAGS组之间共有521个差异基因,与NC-PGK1lowAGS组比较,在PGK1lowAGS组表达上调的基因有369个,表达下调的基因有152个。GO富集分析发现总共富集到了22种生物学过程、9种细胞成分和10种分子功能。差异基因主要涉及:生长过程、代谢过程、粘附过程、细胞杀伤、繁殖、细胞定位和细胞运动等过程,和抗氧化能力、催化能力、酶调节活性、活动分子传感器、运输功能和受体调节能力等功能。KEGG主要富集到了41条信号通路,主要包括氨基酸代谢通路、趋化因子信号通路、AGE-RAGE信号通路、TGF-beta信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用、TNF信号通路、细胞粘附分子（CAM）、IL-17信号通路、肿瘤相关信号通路等。2.PGK1对H.pylori感染胃上皮细胞转录组水平的作用（1）NC-PGK1lowAGS与NC-PGK1lowAGS-Hp组之间共有502个差异基因,与NC-PGK1lowAGS相比,在NC-PGK1lowAGS-Hp组表达上调的基因有309个,表达下调的基因有193个,GO富集分析的结果与PGK1低表达胃上皮细胞的结果基本一致。KEGG分析主要富集到了43条信号通路,主要包括DNA复制、错配修复、ECM受体交互、细胞周期、凋亡、p53信号通路、谷胱甘肽代谢、中心碳代谢途径、精氨酸和脯氨酸代谢、粘附斑、TNF信号通路等。（2）PGK1lowAGS与PGK1lowAGS-Hp之间共有1928个差异基因,与PGK1lowAGS相比,在PGK1lowAGS-Hp组表达上调的基因有1053个,表达下调的基因有875个。KEGG富集分析主要富集到了43条信号通路,主要包括中心碳代谢途径、DNA复制、错配修复、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢、凋亡、肿瘤相关的Micro RNAs、细胞衰老等。（3）NC-PGK1lowAGS-Hp和PGK1lowAGS-Hp之间共有2643个差异基因,与NC-PGK1lowAGS-Hp相比,在PGK1lowAGS-Hp组表达上调的基因有1619个,表达下调的基因有1024个。KEGG富集分析主要富集到了39条信号通路,主要包括MAPK信号通路、肿瘤相关的Micro RNAs、PI3K-Akt信号通路、肿瘤相关通路、松弛素信号通路、生长激素的合成、分泌和作用、GABA能突触、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。综上,PGK1可能通过多种信号通路参与H.pylori感染介导胃癌的进展过程。结论:1.H.pylori感染通过上调ROS生成和MITF表达促进胃上皮细胞的线粒体自噬。2.H.pylori感染诱导胃上皮细胞PGK1线粒体移位,促进糖酵解。3.p53可抑制H.pylori诱导的线粒体ROS生成,及MITF和PGK1的表达,进而抑制线粒体自噬和糖酵解,H.pylori感染抑制p53的表达减弱其上述作用。4.PGK1在胃癌组织高表达,H.pylori感染通过上调PGK1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭及迁移。5.PGK1可能通过调控p53、HIF-1α、MAPK和TNF等信号通路,参与H.pylori介导胃癌的进展过程。