心血管疾病的发病原因及对机体的损伤已越来越受到临床和研究的关注。在人群中,高血压(hypertension)和高血脂(hyperlipidemia)是引起血管系统疾病的常见原因,尤其是动脉粥样硬化(atherosclerosis)形成的重要危险因素。随着研究的进行,一氧化氮(nitric oxide,NO),一氧化碳(carbon monoxide,CO),硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)被认为是体内的三种气体信号分子,在多种系统发挥着广泛的调节作用。NO一直被认为是内皮依赖性的舒张因子,是内脏和全身血液循环的关键调节因素。可调节细胞增殖和心血管中枢活动。抑制NO的产生可以剂量依赖性的使血压升高并可引起相关的机体损伤,在大鼠使用L-NAME阻断了NO的产生可引起脂代谢的代谢异常和升高胆固醇的水平,在高胆固醇血症的模型上NO的降低可观察的内皮功能的损伤和动脉粥样硬化。H2S自发现以来一直被认为是一种毒性气体。近年研究发现可以在哺乳动物体内内源性生成。研究报道内源性H2S对心血管系统有一定的保护作用。动物实验中发现,外源性应用H2S可保护心脏的缺血再灌注损伤,H2S可以降低自发性高血压大鼠(SHR)的血压。但H2S对于肝脏的作用却研究较少,已有研究发现H2S可以保护CCl4和门静脉结扎所致的大鼠肝硬化损伤,H2S同样可以保护肝脏的缺血再灌注损伤。应用L-NAME导致的高血压大鼠模型除了表现为血压升高外还伴随着血清脂质和脂蛋白的异常。如能探明在肝脏中H2S与NO的关系以及内源性H2S水平与心血管疾病危险因素的关系,则可对心血管疾病的防治提供新的思路。第一部分硫化氢抗L-NAME所致的大鼠肝脏损伤和心血管风险目的:通过复制亚硝基左旋精氨酸(NG–nitro-L-arginine methylester,L-NAME)诱导的大鼠模型并外源性给予H2S的供体硫氢化钠(Na HS,sodium hydrosulfide)和格列苯脲(glibenclamide,Gli,KATP通道阻断剂),以研究H2S对L-NAME所致的大鼠肝损伤的保护作用和心血管风险。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,动物随机分为6组,分别为:对照(con组),L-NAME组,con+格列苯脲组(con+Gli组),con+硫氢化钠组(con+Na HS组),L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组,每组各6只。硫氢化钠组大鼠采用硫氢化钠(56μmol/kg)每日腹腔射;其余组大鼠每日腹腔注射相应剂量的生理盐水。L-NAME组大鼠给予配制好的L-NAME水溶液每日日常饮用。格列苯脲组大鼠给予配制好的格列苯脲水溶液每日日常饮用。各组大鼠每周测量尾动脉收缩压。大鼠给予处理5周后,留取血清和肝脏组织测量血清甘油三脂(TG,triglycerides),高密度脂蛋白(HDL,high-density lipoprotein),低密度脂蛋白(LDL,low-density lipoprotein),总胆固醇(CHO total cholesterol),谷丙转氨酶(ALT,glutamic-pyruvic transaminase);通过显微镜观察肝组织细胞排列,组织学结构稳定程度,门管区结构,脂肪空泡出现和淋巴细胞浸润等。结果:1大鼠模型评价:与con组大鼠相比,各组大鼠的食物摄入量和水的摄入量和体重随实验周数逐渐增加,组间差异无统计学意义。各组大鼠均未出现严重疾病、死亡的情况。2大鼠血压的变化:在给予处理前各组的尾动脉收缩压无统计学差异。在给予处理后,L-NAME组大鼠的尾动脉收缩压逐渐升高,L-NAME+Na HS组血压较L-NAME组显著降低。L-NAME+Na HS+Gli组血压较L-NAME+Na HS组血压升高,与L-NAME组比较无统计学差异。3肝功能指标的变化:血清CHO和ALT各组之间没有统计学差异。con组,con+Na HS组,con+Gli组的LDL和TG含量各组之间没有统计学差异。L-NAME组LDL和TG较con组明显升高,L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组的LDL和TG较L-NAME组比明显降低,但两组之间没有统计学差异。con组,con+Na HS组,con+Gli组的HDL含量各组之间没有统计学差异。L-NAME组HDL较con组明显降低。L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组的HDL较L-NAME组比明显升高,但两组之间没有统计学差异。4肝脏组织病理形态学观察:肝脏组织HE染色后镜下可见con组,con+Na HS组,con+Gli组肝小叶结构清晰、完整,肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状整齐排列。L-NAME组肝小叶结构紊乱,纤维结缔组织增生,部分肝细胞体积增大、胞浆内可见大小不等圆形空泡,部分肝细胞可见气球样变;中央静脉周围及汇管区可见炎性细胞浸润。L-NAME+Na HS组和L-NAME+Na HS+Gli组的肝脏组织病理学变化介于con组和L-NAME组之间。小结:本研究证实应用NO合酶抑制剂L-NAME造成大鼠血压的升高、肝脏的损伤和血清肝脏功能相关指标的变化。应用H2S的供体Na HS可以降低L-NAME诱导的大鼠血压的升高并保护其肝脏的损伤,下调血压的作用可以被KATP通道的阻断剂格列苯脲阻断,但苯脲阻断不能阻断H2S对肝脏的保护作用。第二部分硫化氢通过调节e NOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝脏损伤目的:复制L-NAME诱导的大鼠模型并外源性给予H2S的供体Na HS和格列苯脲(Gli),通过检测血浆中NO和H2S以及使用分子生物学技术研究H2S保护L-NAME所致的大鼠肝脏损伤的作用机制。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,动物随机分为6组,分别为:对照(con组),L-NAME组,con+格列苯脲组(con+Gli组),con+硫氢化钠组(con+Na HS组),L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组,每组各6只。硫氢化钠组大鼠采用硫氢化钠(56μmol/kg)每日腹腔射;其余组大鼠每日腹腔注射相应剂量的生理盐水。L-NAME组大鼠给予配制好的L-NAME水溶液每日日常饮用。格列苯脲组大鼠给予配制好的格列苯脲水溶液每日日常饮用。大鼠给予处理5周后,留取血浆和肝脏组织测量血浆H2S的含量,测量肝组织中NO的含量,Western blot法检测肝脏组织e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表达。结果:1血浆H2S含量的变化:con组,con+Na HS组,con+Gli组的血浆H2S含量各组之间没有统计学差异。L-NAME组血浆H2S较con组明显降低。L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组的血浆H2S较L-NAME组比明显升高,但两组之间没有统计学差异。2肝脏组织NO的变化:con组,con+Na HS组,con+Gli组的肝脏组织NO含量各组之间没有统计学差异。L-NAME组肝脏组织NO较con组明显降低。L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组的肝脏组织NO分别较L-NAME组比明显升高,两组之间没有统计学差异。3肝脏组织蛋白表达:结果采用目的蛋白的灰度值与内部参照GADPH作比较。con组,con+Na HS组,con+Gli组的肝脏组织e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表达各组之间均没有统计学差异。L-NAME组肝脏组织e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表达均较con组明显降低。L-NAME+Na HS组,L-NAME+Na HS+Gli组的肝脏组织e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表达均较L-NAME组比明显升高,但两组之间没有统计学差异。小结:本研究证实应用NO合酶的抑制剂L-NAME大鼠血浆H2S和NO含量降低,下调了肝脏组织e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白的表达。应用H2S的供体Na HS可以上调L-NAME诱导的大鼠血浆H2S和NO含量,上调肝脏中与NO合成相关蛋白的表达。这种调节作用不能被格列苯脲阻断,即不是通过KATP通道发挥的作用,可能是通过激活AKT-e NOS通路起到的。第三部分硫化氢通过调节e NOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝细胞损伤目的:通过体外培养原代肝细胞实验,来探讨H2S体外应用是否可通过直接调节e NOS/AKT途径而保护L-NAME所致的大鼠肝细胞损伤即通过调节e NOS/AKT的磷酸化上调肝脏细胞一氧化氮的生成。方法:肝脏细胞的分离和培养参Sprague-Dawley雄性大鼠通过门静脉灌流消化液方法分离肝脏细胞,并采用台盼蓝排斥法测定肝细胞活力。选取细胞活率在90%以上的肝细胞进行培养。肝脏原代细胞分为对照组(con组),con+Na HS(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)组。药物作用时间均为8小时。收集细胞培养基上清检测NO的含量,采用NO的特异性荧光探针DAF-FM DA(3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein,diacetate)测量细胞内NO的变化,western blot法检测肝脏原代细胞中e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表达。结果:1肝原代细胞生长情况:本实验成功分离大鼠肝细胞,平均细胞活力92.5士0.68%.倒置显微镜下观察,新分离的离体肝细胞为透亮圆形,呈单个分散状态。细胞培养2h后开始出现贴壁、伸展现象,培养24h后大约90%的肝细胞完全贴壁,贴壁的肝细胞呈典型的上皮细胞样的多角形,胞体变平变薄,体积明显增大,可见许多双核细胞,细胞间开始出现岛状连接。少数活力差的细胞悬浮于培养液中,换液时可以去除。培养2d后,贴壁生长的肝细胞的形态改变更加明显,肝细胞拉平、伸展,紧紧粘附于培养瓶底壁,相互融合,连接成片、岛状。2细胞上清中NO含量变化:con组,con+Na HS(100μmol/L)组的细胞上清中NO含量之间没有统计学差异。L-NAME组细胞上清中NO含量较con组明显降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)组的细胞上清中NO含量较L-NAME组比明显升高,但两组之间没有统计学差异。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)组细胞上清中NO含量与L-NAME组比没有统计学差异。3细胞中NO含量的变化:con组,con+Na HS(100μmol/L)组的细胞中NO的生成较为相近。L-NAME组细胞中NO的生成较con组明显降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)组的细胞中NO的生成较L-NAME组比明显升高,但两组之间没有统计学差异。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)组细胞中NO的生成与L-NAME组比没有统计学差异。4细胞中相关蛋白的变化:Western blot法检测肝脏细胞中e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表达。结果采用目的蛋白的灰度值与内部参照GADPH作比较。各组的肝脏细胞中e NOS,AKT,蛋白表达各组之间均没有统计学差异。con组,con+Na HS(100μmol/L)组P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表达各组之间均没有统计学差异。L-NAME组细胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表达较con组明显降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)组,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)组细胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表达均较L-NAME组比明显升高,但两组之间没有统计学差异。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)组细胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表达与L-NAME组比没有统计学差异。小结:本研究证实应用NO合酶抑制剂L-NAME后大鼠肝脏原代细胞NO生成减少,此作用是通过下调肝脏细胞P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白的表达即减低了e NOS,AKT的磷酸化。应用H2S的供体Na HS可以上调肝脏原代细胞NO的生成和相关蛋白的表达。这种调节作用不能被格列苯脲阻断,可以被AKT的阻断剂LY294002阻断,表明H2S调节NO生成不是通过KATP通道发挥的作用;而是通过激活AKT-e NOS通路实现的。