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从南京工业大学生物与制药工程学院获得一株小球藻藻种,经划线培养数代后,得到分离纯化的小球藻,18S rDNA鉴定确定其种属为普通小球藻。培养小球藻常见的几种培养基有BG11培养基,Knop培养基和Basal培养基。本研究接种同批等量小球藻在相同的培养条件下进行培养,测得OD值并绘制其生长曲线,结果表明BG11培养基最适合该小球藻的生长。牛粪浸出液代替传统培养基培养小球藻的梯度对照实验中,发现牛粪浸出液培养小球藻的效果很好,且浓度越高,生长状况越好,节省了成本并提高了产量,有利于产油微藻小球藻的大规模培养,同时还对小球藻的粗脂含量做了测定,每克小球藻干粉中粗脂的含量约为0.206 g,占小球藻干重的20％左右。
本研究继续对经分离纯化并且培养状态良好的小球藻进行双链RNA的抽提,从小球藻中得到10条基因组序列,纯化后用M-SPAT法获得了其中dsRNA6的对应DNA片段,并将其克隆测序,进行序列分析、序列功能预测及进化树分析。结果显示,所测克隆的序列dsRNA6,大小为1584 bp。末端非编码区(Untranslated Region,UTR)分析结果显示,dsRNA6的5’端UTR长度为105 bp,3’端UTR长度为42 bp,最大ORF(open readingframe,ORF)编码一个由478氨基酸组成的蛋白,分子量大小为54.2 kDa。NCBI数据库中BLAST程序搜索,结果显示,dsRNA6核苷酸序列与双分病毒科的潜隐病毒的序列的相似度约70％。dsRNA6最大的ORF推测编码某未知双分病毒科病毒成员的RdRp(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)。相似度较高的前几个序列均源于侵染植物的双分病毒科a潜隐病毒属病毒,双链RNA病毒的RdRp中存在的八个保守motif,在dsRNA6推测编码的蛋白序列中也都存在。进化树分析结果显示,dsRNA6与侵染植物的Alphacryptovirus聚在一起形成簇,进化距离较近,与侵染真菌的Partitivirus进化距离则相对较远。我们也采用了第二代测序技术对样品序列进行分析,发现了一些与病毒相关的信息。高通量测序拼接结果DSR1,核苷酸序列长为589 bp,NCBI比对结果,与狒狒正呼肠孤病毒(Baboon orthoreovirus)L3片段的部分核酸序列的最大相似性度可达到100％。二者核酸序列比对结果,DSR1与狒狒正呼肠孤病毒(Baboon orthoreovirus)L3片段(1456bp-2109bp)的序列相似度为84％。DSR1经Editseq翻译的蛋白序列与与狒狒正呼肠孤病毒编码的核壳蛋白(core shell protein)序列相似。推测DSR1是一种新的呼肠孤病毒科病毒的部分序列且编码核壳蛋白,该双链RNA病毒可以侵染小球藻。高通量测序拼接结果DSR2,核苷酸序列长为2722 bp,NCBI上与巨大海洋病毒(Cafeteria roenbergensisvirus BV-PW1)相似度为80％。其蛋白序列与巨大海洋病毒BV-PW1的未知蛋白(hypothetical protein)序列相似。推测DSR2是一种新的巨大海洋病毒中的基因序列并且编码hypothetical protein。高通量测序拼接结果DSR3,核苷酸序列长为1117 bp,NCBI的比对结果,与机湖藻DNA病毒(Organic Lake phycodnavirus2)的相似度为86％。其蛋白序列的80-237 bp和0-343 bp分别与Organic Lake phycodnavirus2中的2个hypotheticalprotein序列相似,并且DSR3蛋白序列0-343 bp与Organic Lake phycodnavirus2具有部分相同的推测的特异性DNA甲基化酶位点。推测DSR3是侵染小球藻的一种藻类DNA病毒序列,编码hypothetical protein序列。
本研究采用18S rDNA的方法鉴定了一株小球藻并优质培养,获得了一种高产量、低成本、大量培养该小球藻的方法。小球藻粗脂提取的结果表明此小球藻中油脂含量约占小球藻干重的20％,属于产油量较高的微藻。小球藻病毒研究过程中,M-SPAT和TA克隆的方法获得了一条某未知双分病毒科成员的RdRp序列。高通量测序的结果发现一种新的呼肠孤病毒科病毒的部分序列,一种新的巨大海洋病毒基因序列以及一种侵染小球藻的藻类DNA病毒序列。首次发现了多条双链RNA病毒和双链DNA病毒同时侵染一种小球藻的现象。本研究为藻类病毒研究工作积累了信息,对新能源的开发有重要的意义。此外,本研究首次尝试了第二带高通量测序技术检测多条未知双链RNA样品。为以后的高通量测序研究,提供了经验。