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目的:热休克蛋白90α(HSP 90α)是细胞受应激原刺激后诱导产生的一种应激蛋白,在肿瘤组织中HSP90α表达量达正常组织表达水平的2-10倍。其在血液中的含量与肿瘤恶性程度呈正相关。HSP90α作为一种全新肿瘤标志物,用于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多个肿瘤的临床检测。患者血浆中HSP90α含量水平对应患者病情变化,可实时、较准确地反映治疗效果,在临床上可为医生提供诊断、治疗、预后的客观依据。本实验针对此蛋白进行系统研究,建立人血清中热休克蛋白90α(HSP90α)的荧光免疫层析定量检测方法。方法:1、采用人HSP90α融合蛋白,进行抗原纯度、浓度和生物活性的鉴定,免疫小鼠、利用间接酶联免疫吸附法(ELISA)效价鉴定、细胞融合、单克隆抗体制备、单抗纯度和亚型鉴定、蛋白纯化等实验操作步骤制备纯度较高的HSP90α单克隆抗体和多克隆抗体。2、研制用于定量检测的荧光免疫层析检测试纸条,通过采用荧光免疫层析技术,对荧光微球制备工艺进行优化,并对最佳反应时间、线性范围、精密性、回收率、临床检测等性能评价方面进行系统研究。初步建立了热休克蛋白90α荧光免疫层析检测方法。结果:1、共筛选出16株单克隆细胞株,经过亚型筛选以后共选出8株阳性细胞株,编号分别为3B2、4E3、4F4、5E2、7D1、7E4、8F2、8G4。2、经过8株单抗和多抗配对,挑选出8F2和多抗成为最优的一对配对抗体。确定了各反应条件,最佳反应时间为5min。线性范围0.39ng/m L-100ng/m L;灵敏度为0.0578ng/ml;精密性质控品高值(30ng/m L)CV=7.46%;低值(10ng/m L)CV=8.39%,高、中、低值血清的回收率分别为100.56%、99.76%、94.1%;与国外HSP90αELISA检测试剂盒平行检测40份临床患者血清,结果显示两者相关系数为0.9685。结论:1、通过单克隆抗体制备的实验过程,成功筛选出8株阳性细胞株,并挑选出一对配对抗体用于后续实验的研究。2、超声波技术在荧光微球活化过程中可降低聚集现象。3、初步建立的方法具有良好的精密性和线性,临床符合率能满足临床检测技术要求,有望完善后报批用于临床。