【摘 要】
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目的:本研究目的是探讨雷帕霉素通过调节星形胶质细胞中m TOR信号通路介导星形胶质细胞的活性,并进一步研究雷帕霉素对视网膜神经节细胞（RGC）的保护机制。方法:用表皮生长因子（EGF）诱导的细胞作为细胞活化模型,将细胞随机分为空白对照组（CON）、EGF组、药物组（RAPA组/LY组/PD组）和EGF+药物组四组,利用m TOR通路抑制剂雷帕霉素（RAPA,10μM）及其上游两条途径抑制剂LY29
【基金项目】
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国家自然科学基金委项目（NO,81271425,NO81260148）
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目的:本研究目的是探讨雷帕霉素通过调节星形胶质细胞中m TOR信号通路介导星形胶质细胞的活性,并进一步研究雷帕霉素对视网膜神经节细胞（RGC）的保护机制。方法:用表皮生长因子（EGF）诱导的细胞作为细胞活化模型,将细胞随机分为空白对照组（CON）、EGF组、药物组（RAPA组/LY组/PD组）和EGF+药物组四组,利用m TOR通路抑制剂雷帕霉素（RAPA,10μM）及其上游两条途径抑制剂LY294002（50μM）和PD98059（25μM）处理EGF刺激后的细胞,用蛋白免疫印记法检测m TOR通路可能经过的两条途径相关蛋白:p-Erk、p-Akt、p-S6K和p-m TOR的表达水平。体内实验中,将大鼠随机分配到正常对照（CON）组、缺血再灌注（6h、3d或7d I/R）组、雷帕霉素（RAPA）组和缺血再灌注加雷帕霉素处理（6h、3d或7d I/R+RAPA）组,采用蛋白免疫印迹法检测各组视网膜中相关蛋白:p-Akt、p-S6K和p-m TOR的表达量;以及凋亡相关蛋白:Caspase-3的表达水平;免疫荧光染色法检测视网膜或视乳头部位的p-S6和GFAP的原位表达水平;通过对视网膜进行横向切片或平铺,用针对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白（Vimentin）抗体进行胶质细胞的活性评估,还使用蛋白免疫印迹来检测GFAP的表达。用荧光金逆行标记并计算RGC细胞存活率。结果:1.EGF和RAPA药物处理后p-m TOR及p-S6K蛋白的变化:与CON组比拟EGF组明显升高（p0.05）;EGF+RAPA组与EGF组相比显著降低（p<0.01或p<0.05）。2.经两种抑制剂处理的EGF依赖性星形胶质细胞的p-Erk和p-Akt的变化:与CON组比拟EGF组均明显升高（p<0.01或p<0.05）;与EGF组相比,EGF+LY组及EGF+PD组均明显降低（p<0.01或p<0.001）。与EGF组相比,EGF+LY组p-S6K表达显著降低差异均有统计学意义（p0.05）。3.在3天模型蛋白免疫印迹中:与I/R组相比,RAPA+I/R组的p-Akt（Thr308）表达明显升高（p<0.01）而p-m TOR和p-S6K表达明显降低（p<0.01或p<0.001）。4.6h和3d模型的免疫荧光结果显示p-S6表达水平:与CON组比拟I/R组表达均明显升高,I/R+RAPA组与I/R组相较表达有所降低。而6h和3d模型荧光染色检测GFAP结果显示,与CON组相比,I/R组GFAP的表达增多（p<0.05）,细胞形态发生改变;和I/R组相比,I/R+RAPA组GFAP的表达降低（p<0.05）,细胞形态呈现回缩的趋势,形态更加接近正常组,雷帕霉素对Vimentin的表达影响并不显著。5.荧光金逆行标记结果显示与CON组比拟I/R组RGC存活量均明显减少,差异有统计学意义（p0.05）;I/R+RAPA组与I/R组相比RGC的存活量明显升高且差异有统计学意义（p<0.05）。结论:表皮生长因子诱导星形胶质细胞中m TOR信号通路的活化可能主要通过PI3K/Akt途径来激活,而不是Erk/MAPK途径。雷帕霉素可以通过抑制m TOR信号通路介导调节星形胶质细胞的活性。雷帕霉素有效减少RGCs细胞凋亡的发生,雷帕霉素可能具有治疗RGCs丢失相关疾病的潜力。
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