丝状真菌红曲菌(Monascus spp.)是我国及东南亚国家传统的发酵微生物,主要用于红曲的生产。红曲菌可以产生多种有益的次级代谢产物,如降血脂药物莫纳可林K、降血压药物γ-氨基丁酸和食品着色剂红曲色素(Monascus pigments, MPs)等,同时还可以分泌一种肾脏毒素——桔霉素,导致红曲产品受到污染。MPs是红曲菌产生的最主要的次级代谢产物之一,是具有类似结构(嗜氮酮)的一类化合物的总称,主要有红、橙和黄3类色素组分,现在已经有超过50种MPs被鉴定。除了着色功能外,部分MPs还具有抗氧化、消炎和抗癌等生物学活性。研究表明,MPs按照聚酮合成途径合成,但是至今未分离到该合成途径中的任何中间产物,也未克隆到控制MPs合成的基因。聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)是聚酮合成途径的限速酶,主要存在于植物、细菌和真菌中。按照结构和催化机理,PKS可以分为模块型(Ⅰ型)、重复型(Ⅱ型)、查尔酮型(Ⅲ型)和重复Ⅰ型4类。真菌中的PKS大多属于重复Ⅰ型PKS。重复Ⅰ型PKS是多功能蛋白,拥有多个具有不同催化功能的结构域,根据PKS中结构域的种类,这类PKS又进一步被划分为8类,分别是4种非还原型PKS(非还原Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅰ&Ⅱ型、Ⅲ型)和4种还原型PKS(还原Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型)。虽然不同的重复Ⅰ型PKS拥有的结构域种类和数目不同,但是它们都有3个必需的保守结构域,即β-酮酯酰基合成酶(β-ketosynthase, KS)、酰基载体蛋白(Acyl carrier protein, ACP)和酰基转移酶(Acyltransferase, AT),因此,通常根据这一保守性设计简并引物,从真菌中克隆新的PKS基因。研究发现,真菌中控制聚酮类化合物合成的相关基因通常以基因连锁的形式存在,形成所谓的基因簇。在聚酮类化合物基因簇中至少存在1个PKS基因和1个簇内调节基因。根据这一特点,已经从真菌中克隆到很多聚酮化合物的基因簇,并结合基因簇的分析,探明了部分聚酮化合物的生物合成途径。本研究依据以上理论基础,根据保守的KS结构域设计简并引物从红色红曲菌(M ruber) M-7基因组中克隆得到控MPs合成的PKS基因,并根据M-7基因组的测序结果,获得了色素PKS基因簇；借助生物信息学分析方法对基因簇中基因进行了功能预测,并对其中部分基因的功能进行了鉴定；此外通过基因过表达技术获得了高产MPs低产桔霉素的基因工程菌。研究成果如下。1与MPs合成相关的PKS基因克隆从NCBI上收集了253条主要来自曲霉属(Aspergillus),青霉属(Penicillium)和红曲菌属(Monascus)的PKS的KS结构域,并构建了基于KS结构域的系统进化树。根据进化树分析结果,设计简并引物,从M-7基因组中克隆得到4个PKS基因,后期试验证实其中一个PKS基因与MPs合成相关,命名为pksPTo2 MPs合成基因簇分析通过分析本实验室测序完成的M-7基因组序列,获得了包括pksPT在内的由17个基因组成的MPs基因簇。对簇内的pksPT、调节基因(pigR),脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, FAS)α亚基基因(fasa)和β亚基基因(fasβ)进行了分析,发现pksPT编码的蛋白属于非还原III型PKS,结构域组合形式为KS-AT-ACP-ACP-ME(甲基转移酶)；pigR编码的蛋白属于Zn(Ⅱ)2Cys6型锌指蛋白,DNA绑定基元为CdnCrkkkvkCdakkpaCs (C是半胱氨酸；其他字母为其他氨基酸缩写)；fasa编码的蛋白包含ACP、KS、KR (β-ketoreductase)和PPT (Phosphopantetheinyl transferase)4个结构域；fasβ编码的蛋白包含AT、ER (Enoylreductase)、DH (Dehydratase)和MT (Malonyl transferase)4个结构域。3基因敲除菌株的构建及性质分析根据同源重组原理,构建pksPT、pigR、fasa和fasβ单敲除菌株△pksPT、ApigR、 △fasa和△fas△,并分析了各敲除菌株菌落形态、产孢能力、生长速度、色素和桔霉素产量。结果显示,各基因的敲除均不影响红曲菌产分生孢子和闭囊壳的能力；各敲除子生长速度均比出发菌株M-7快,其中△pksPT生长速度最快；HPLC分析显示各敲除子均丧失产MPs的能力；菌落形态观察显示,△pksPT和△pigR菌落呈白化现象,而△fasa和△fasβ菌落呈黄色,并且在△fasa和△fasfβ菌落周围有大量黄色物质积累,通过与M-7菌落比较说明该黄色物质可能与MPs中间产物有关；△pksPT, △pigR、△fasa和△fasβ产桔霉素能力显著提高,分别是M-7的3.8、2.3、2.2和2.4倍。这些结果说明pksPT、pigR、fasa和fasβ是MPs合成途径中的关键基因。△pigR基因过表达菌株的构建以出发菌株M-7和△pigR为受体,分别构建了组成型trpC启动子控制的pigR基因过表达菌株ptrpC::pigR和pigR-complemented △pigR,分析了过表达菌株菌落形态、产色素和桔霉素的能力以及pigR的表达量。结果显示,ptrpC::pigR和pigR-complemented △pigR的菌落直径明显小于M-7; ptrpC::pigR和pigR-complemented ApigR产MPs的能力较M-7显著提高,在PDB培养基中培养7d时,红色素产量分别提高了约9倍和10倍,黄色素产量分别提高了1倍和0.5倍,此时,M-7没有开始合成橙色素,而ptrpC::pigR和pigtR-complemented ApigR已经合成7种橙色素,产量分别达2.5和4.2 U/g-dried mycelia; pigR的表达量在ptrpC∷pigR和pigR-complemented △pigR中分别比M-7提高了2万倍和3.5万倍；而ptrpC::pigR和pigR-complemented ApigR中桔霉素的产量大约是M-7的30%。这些结果说明过表达pigR基因能够有效地提高MPs产量同时降低桔霉素产量。5 MPs中间产物的分析与MPs合成途径的探讨在敲除fasa时分离得到1株突变子,命名为ISM (Itermediate secreting mutant),该突变子可以产生1种MPs可能中间产物。以△pksPT为材料,采用菌落共培养试验和中间产物添加试验对该中间产物进行了验证。结果显示,ISM与△pksPT共培养导致△pksPT重新产生一些色素,推测ISM可以产生色素合成中间产物；采用HPLC对突变子菌落周围培养基进行分析,发现ISM菌落周围大量积累一种物质,而△pksPT不能产生该物质,推测该物质可能是导致△pksPT恢复合成色素的物质；向△pksPT液体培养物中加入该物质,△pksPT重新产生MPs。这些结果表明该物质是色素合成途径中的中间产物。进一步将ISM与△fasβ共培养,并采用HPLC分析了它们菌落周围培养基中该中间产物的含量。结果显示,与ISM共培养的△fasfβ不能重新产生Ⅷs；在△fasβ菌落周围仅存在少量该中间产物,其含量与M-7菌落周围该物质的含量相差不大。以上结果显示该中间产物能够使△pksPT重新合成MPs而不能使△fasβ重新合成MPs,预示该中间产物可能位于PKS和FAS合成的产物之间。