人体菌群PCR-HRM指纹及其法医学应用

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[背景]人类的健康和疾病与人体菌群息息相关。由于性别、年龄、生活环境、饮食习惯、健康状况等的不同,不同个体、同一个体不同部位的细菌菌群组成不相同。人体菌群很容易转移到现场物品上,或随分泌物、排泄物遗留在现场,甚至比人体细胞的数量还多,且能在一定时间内保持菌群原有的特性。人死后,尸体各处的菌群随腐败进展而发生有规律的变化。现场检材或尸体的菌群特征,可提供斑痕类型、来源个体及死亡时间等信息,菌群分析作为解决法医学问题的新途径日益受到关注。菌群可用形态、生化和遗传学等方法进行分析,但受检材条件等限制,法医学菌群分析多数为菌群的DNA分析。但是传统的菌群DNA分析需要菌群培养、提取和电泳等,耗时费力,分辨率和灵敏度低,所得信息少、信息易失真,难以满足法医学应用要求。菌群的宏基因组高通量测序可提供大量的信息,但是价格昂贵,设备和技术要求高,难以普及或直接用于样本筛查。高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)简单快速,灵敏度和信息含量高,已应用于变异或突变筛查、病原体快检、法医DNA分型等。其在菌群分析中的应用,目前已有初步探索。直扩PCR(direct PCR,dPCR)已是成熟的法医DNA分型技术,在菌落筛选、病原体诊断中也有应用,可以简化操作、缩短时间,是宏基因组分析快速化的另一潜在途径。[目的]建立一种基于dPCR和HRM的唾液菌群快速检测技术,初步评估其法医学应用的可行性。[方法]以唾液为例,离心收集样本中的细菌后溶解于TE(Tris-EDTA)缓冲液,直接作为模板用荧光PCR仪进行扩增和HRM分析,即dPCR-HRM。同步分析细菌基因组DNA提取试剂盒(kit)提取的菌液DNA模板,即k PCR-HRM,作为对照。调查不同个体样本、稀释样本和唾液斑样本,比较HRM图谱,计算判型置信度(genotype confidence percentage,GCP),评价dPCR-HRM的可行性。[结果]1.通过以单一细菌多杀性巴氏杆菌PAO1 16S rDNA V4区的DNA片段为模板,不断地实验优化体积参数,初步建立了PCR-HRM用于检测菌群的方法。2.dPCR-HRM法可在90min内得到与k PCR-HRM法相似的(GCP>95.85%)样本特异性图谱。同一唾液样本稀释(35-3500倍)或者在不同时间检测,所得HRM图谱基本不变(GCP>92.11%)。3.以GCP≥80.00%为标准,61例唾液样本可分为10种基本类型。唾液斑可用纱线转移法分析,至少在8h内HRM图谱相对稳定(GCP>90.83%)。[结论]1.dPCR-HRM法可在90min内得到唾液的HRM图谱。2.dPCR-HRM技术可用于唾液菌群的经济、快速分型,有较高的灵敏度、检材适应性。
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