乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的持续感染与肝癌的发生具有十分密切的关系,由乙肝病毒X开放读码框编码的X蛋白(HBx)可通过蛋白和蛋白的相互作用作为反式激活因子在肝癌的发生中起重要作用。然而,HBx的致癌作用机理目前仍不十分清楚。我们前期研究工作发现,在肝癌组织中乙型肝炎病毒x抗原(HBxAg)和survivin均有较高水平的表达。因此,我们提出"HBx和survivin协同转化"。为了进一步阐明HBx与肝癌发病的关系,本研究应用人肝细胞系和鼠纤维母细胞系,探讨了HBx与survivin协同转化致癌作用的分子机制,主要研究内容如下:　　 一、建立稳定表达HBx和/或survivin的细胞系　　 为了探讨乙肝病毒X蛋白在肝癌发生中的作用,建立稳定转染所研究基因的细胞模型具有十分重要的意义。本研究通过基因转染技术将克隆有乙肝病毒X基因和survivin基因的质粒分别和共同导入培养的人肝细胞系L-O2和鼠纤维母细胞系N1H3T3中,经G-418筛选,获得了稳定细胞系,分别将其命名为L-O2-P/3T3-P(转染空载体),L-O2-X/3T3-X(转染X基因),L-O2-S/3T3-S(转染survivin基因),L-O2-XN-SC/3T3-XN-SC(转染X基因和survivin基因的突变体)和L-O2-X-S/3T3-X-S(转染X和survivin基因)。利用上述细胞进行基因组PCR和Western blot及免疫荧光检测,显示L-O2-X/3T3-X和L-O2-X-S/3T3-X-S细胞中存在X基因的整合及X蛋白的表达,L-O2-S/3T3-S和L-O2-X-S/3T3-X-S细胞中存在外源survivin基因的整合及survivin蛋白的表达,L-O2-XN-SC/3T3-XN-SC细胞中存在X基因和survivin基因突变体的整合和相应蛋白的表达。　　 二、HBx、survivin和HBXIP蛋白三者关系的研究　　 在前期实验结果和文献报道的基础上,应用免疫共沉淀、RNA干扰和激光共聚焦实验方法,阐明HBx、survivin和HBXIP三者的相互关系。该研究的主要内容有以下几个方面:第一,用人肝细胞系L-O2,通过基因转染技术瞬时过表达X蛋白和survivin蛋白后进行免疫共沉淀实验。结果显示,HBx与survivin相互结合。第二,我们建立了稳定干扰HBXIP的L-O2细胞系并命名为L-O2-pSi-XIP。在此细胞中过表达X蛋白和survivin蛋白。免疫共沉淀实验显示,HBx、survivin和HBXIP三者能相互结合,重要的是结果显示,HBx和survivin的结合通过HBXIP来实现。第三,激光共聚焦实验显示,在L-O2-X-S细胞内HBx和survivin蛋白能够共定位。　　 三、三者复合物的恶性转化作用　　 为了阐明上述各个细胞系的恶性表型,进行了免疫印迹实验。结果显示,在L-O2-X和L-O2-X-S细胞中有甲胎蛋白(AFP)的表达,初步显示这些细胞发生了转化。对癌蛋白的检测发现,L-O2-X-S/3T3-X-S具有转化细胞的特征,细胞恶性表型明显强于L-O2-X/3T3-X和L-O2-S/3T3-S细胞系,癌蛋白呈高水平表达。进一步克隆形成实验的结果显示,L-O2-X-S细胞克隆形成能力相比其他细胞系显著增强。将L-O2、L-O2-P、L-O2.X、L-O2-S、L-O2-XN-SC和L-O2-X-S细胞接种裸鼠后,L-O2、L-O2-P、L-O2.S和L-O2-XN-SC细胞系不能使裸鼠成瘤；L-O2-X细胞接种的裸鼠8只中有3只成瘤；L-O2-X-S细胞接种的裸鼠8只全部成瘤。　　 四、三者复合物致癌分子机制的研究　　 在上述研究基础上,为了阐明三者复合物致癌作用的分子机制,从以下几个方面进行了探索。　　 第一,三者复合物各自在致癌中所扮演的角色。在L-O2和NIH3T3系统中的报告基因实验显示,只有HBx和survivin同时存在,报告基因的活性才显著增强,表明HBx和survivin能够协同发挥转化功能。结合RNA干扰、免疫印迹和报告基因等技术手段,我们发现在转化过程中HBx起主要作用。进而,在L-O2-X和3T3-X两个系统内,瞬时转染survivin、survivin突变体和HBXIP,然后进行报告基因活性的检测。结果显示,survivin在HBx的致癌作用中发挥了重要功能。　　 第二,HBXIP在协同转化过程中发挥功能的研究。借助免疫印迹技术我们发现仅在L-O2-X-S/3T3-X-S中HBXIP的蛋白表达水平大大增加,其他细胞中HBXIP蛋白表达水平无变化。进而我们设计并克隆了HBXIP的两个突变体分别命名HBXIPN83(与HBx结合的部位)和HBXIPC91(与survivin结合的部位)。在L-O2-X-S/3T3-X-S系统中瞬时转染HBXIP、HBXIPN83、HBXIPC91和HBXIP干扰载体。我们发现,过表达HBXIP后报告基因的活性增加,而对HBXIP进行RNA干扰以后报告基因的活性显著降低,过表达HBXIP的两个突变体作用不明显。以上结果说明,当HBXIP被RNA干扰后,三者复合物不能形成,转化作用不能发生。　　 第三,转化过程中microRNA表达谱和基因表达谱的研究。①与L-O2-X和L-O2-S细胞相比,L-O2-X.S细胞中有33种microRNA的表达发生了变化。其中有14种microRNA上调表达(比值≥2.0),19种microRNA下调表达(比值≤0.5)。我们从芯片检测结果中选出两个上调表达和两个下调表达的mieroRNA进行了real-time qRT-PCR验证,显示与芯片获得的结果一致。②根据数据库预测,has-miR-520b和has-miR-520e可能靶向HBXIP。我们人工合成了这两种microRNA和相应的对照序列。实验结果显示has-miR-520b靶向HBXIP。③应用基因芯片技术比较了L-O2、L-O2-X和L-O2-X-S细胞,检测了细胞中基因表达谱的变化。比较L-O2-X和L-O2(对照组)细胞,发现150个有明显差异的基因,呈上调表达(比值≥2.0)的基因有80个,呈下调表达(比值≤0.5)的基因有70个。前期实验结果表明L-O2-S细胞没有发生恶性转化,因而比较L-O2-X-S和L-O2-X细胞,然后去除L-O2-X和L-O2比较后得出一个基因表达谱——协同转化相关的基因表达谱。结果显示,有78个有明显差异的基因,被上调表达的基因有24个,呈下调表达的基因有54个；我们从基因芯片中选出两个基因(PCNA和Bel-2)进行了免疫印迹验证,显示与芯片获得的结果一致。差异表达的基因功能广泛涉及到细胞增殖、细胞分化和转化等多方面。　　 综上所述,我们发现在HBx的导致的恶性转化过程中,HBx、survivin和HBXIP三者形成复合物协同发挥转化功能。HBx和survivin扮演了至关重要的角色,其中HBx作为诱导因子发挥主要功能,survivin也发挥了重要的作用,而HBXIP发挥桥梁的功能连接HBx和survivin,通过三者形成的复合物发挥致癌功能。转化过程中,microRNA has-miR-520b表达水平下调,其靶基因HBXIP表达上调从而适应体内HBx和survivin的表达水平,形成三者复合物。上述研究将为深入揭示HBx的致癌机理提供新的实验依据,可进一步丰富HBx致癌的分子机理,对于肝癌的预防及治疗具有重要的理论价值。