【摘 要】
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目的:确定LncRNA PiHL在奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞中的表达水平,研究Pi HL在结直肠癌细胞奥沙利铂耐药中的作用并探讨Pi HL是否通过与多梳抑制复合物（PRC2）结合介导奥沙利铂的耐药,初步阐明其机理,为结直肠癌治疗提供新思路。方法:1.CCK8法检测奥沙利铂对结直肠癌细胞的抑制率;体外诱导法构建奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞系HCT116-oxa、DLD1-oxa、SW480-oxa、S
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目的:确定LncRNA PiHL在奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞中的表达水平,研究Pi HL在结直肠癌细胞奥沙利铂耐药中的作用并探讨Pi HL是否通过与多梳抑制复合物（PRC2）结合介导奥沙利铂的耐药,初步阐明其机理,为结直肠癌治疗提供新思路。方法:1.CCK8法检测奥沙利铂对结直肠癌细胞的抑制率;体外诱导法构建奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞系HCT116-oxa、DLD1-oxa、SW480-oxa、SW620-oxa;q RTPCR法检测结直肠癌细胞中Pi HL的表达水平;2.利用分子克隆技术构建稳定过表达Pi HL的正常结直肠癌细胞系和稳定干扰Pi HL的奥沙利铂耐药结直肠癌细胞系;CCK8法和流式细胞术检测Pi HL表达水平改变对奥沙利铂作用下细胞的存活率和凋亡比例的影响;3.生信分析和q RT-PCR预测Pi HL与PRC2途径基因之间存在相关性;RNA pulldown和Western blot技术确定Pi HL与EZH2之间的作用关系;RNA-seq与q RT-PCR结合确定PRC2表观遗传作用靶点。结果:1.CCK8实验结果显示:奥沙利铂在DLD1和HCT116细胞中的IC50值显著高于SW620和SW480,q RT-PCR结果显示:DLD1和HCT116细胞中Pi HL的表达水平也相对高于SW620和SW480。体外诱导法成功构建HCT116-oxa、DLD1-oxa、SW480-oxa、SW620-oxa四种奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞株,且耐药细胞株中Pi HL表达水平较正常细胞显著升高,差异具有统计学意义。2.分子克隆技术构建了稳定过表达Pi HL的正常结直肠癌细胞系和稳定干扰Pi HL表达的奥沙利铂耐药结直肠癌细胞系,Pi HL过表达和干扰效率经过q RTPCR验证。CCK8法结果显示:稳定过表达Pi HL可以增加细胞在奥沙利铂处理后的存活率,细胞对奥沙利铂敏感性降低。同时,在耐药结直肠癌细胞系中,干扰Pi HL表达组药物作用下细胞存活率明显低于对照组,细胞对奥沙利铂敏感性增加。3.流式细胞术检测凋亡结果显示:过表达Pi HL能减少奥沙利铂诱导的细胞凋亡,耐药细胞干扰Pi HL表达后药物诱导的凋亡细胞比例显著增高。4.TCGA数据库分析发现Pi HL表达和PRC2的组成成分EZH2、SUZ12、EED的表达存在明显的正相关,q RT-PCR确认结直肠癌组织样本中的中Pi HL的表达与EZH2表达正相关;在HCT116细胞中,RNA pull-down和Western blot实验结果显示体外转录的LncRNA PiHL可以与细胞中EZH2蛋白直接结合;过表达或敲除Pi HL后,EZH2蛋白的表达水平并不改变。5.RNA-seq结果显示干扰Pi HL后存在大量差异表达的基因,包括多个重要的PRC2靶基因;q RT-PCR进一步验证的结果显示,与对照组细胞相比,Pi HL表达下调可以显着增加CDKN2B、KLF2、KLF4、KLF6、RUNX3等抑癌基因的表达。结论:1.Pi HL在奥沙利铂耐药结直肠癌细胞中高表达并且Pi HL可能参与结直肠癌奥沙利铂耐药的相关分子机制。2.Pi HL可以促进结直肠癌细胞奥沙利铂耐药,耐药细胞中干扰Pi HL表达可以抑制细胞增殖,促进药物诱导的细胞凋亡,提高奥沙利铂的敏感性。3.Pi HL通过与多梳抑制复合物中EZH2蛋白结合表观遗传抑制重要的抑癌基因CDKN2B、KLF2、KLF4、KLF6、RUNX3的表达。
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