人单纯疱疹病毒I型(HSV-1)属于疱疹病毒科的α亚科,其可导致HSV-1原发感染再激活引起的唇疱疹,继发感染引起的生殖器疱疹甚至引起疱疹性脑炎导致死亡。目前疱疹病毒具有患病率高、复发性强等特点导致社会资源的浪费和药物耐药性,因此需要进一步从宿主角度出发来研究病毒致病机制,促进新型抗病毒靶点的发现和新型抗病毒药物的开发。本实验室前期研究发现,Hsp90抑制剂AT-533可以阻碍HSV-1的出核和装配并且Hsp90α可以维持HSV-1 VP16的稳定性进而促进极早期基因的转录,表明Hsp90广泛地参与HSV-1发生发展的各个阶段。还有研究表明,Hsp90抑制剂格尔德霉素可降低HSV-1的病毒滴度并导致DNA聚合酶催化亚基p U_L30的异常定位,但是Hsp90通过与哪一病毒蛋白互作来调控HSV-1 DNA复制的机制尚不明确。因此本研究通过聚焦HSV-1 DNA复制相关蛋白来探究Hsp90抑制剂调控HSV-1 DNA复制的机制,从而为Hsp90相关通路提供更多的理论基础和实验证据夯实其作为新型抗HSV-1病毒的作用靶标。首先,本研究通过CCK-8细胞活性实验和CPE细胞病变效应实验,确定了两个Hsp90抑制剂17-AAG和AT-533在人皮肤成纤维细胞HFF中的半数有毒剂量、半数有效剂量和抗病毒工作浓度。并在HFF细胞中进行病毒m RNA转录水平和DNA复制水平的时间点收样和时间点加药的检测,实验结果首次发现Hsp90抑制剂可不通过影响病毒基因转录水平来直接诱导病毒DNA拷贝数的降低。其次,本研究通过蛋白质模拟对接、蛋白质免疫共沉淀、蛋白质免疫印迹和免疫荧光实验等操作,明确了Hsp90抑制剂直接调控HSV-1 DNA复制的机制。第一通过蛋白质模拟对接和蛋白质免疫共沉淀实验得到Hsp90与HSV-1 p U_L42相互作用,表明Hsp90可以通过调控p U_L42蛋白来直接影响HSV-1 DNA的复制。第二通过蛋白免疫印迹和免疫荧光实验,得到Hsp90抑制剂诱导病毒和质粒表达的p U_L42蛋白通过自噬途径降解,并且过表达p U_L42可回复HSV-1 DNA拷贝数。第三通过蛋白免疫印迹和免疫荧光实验得到Hsp90抑制剂不影响HSV-1解旋酶-引发酶的表达,进一步凸显Hsp90抑制剂调控HSV-1 DNA聚合酶连续性因子p U_L42在DNA复制中的关键作用。最后,本研究还通过Autodock分子对接模拟和Ligplot分子对接分析技术探究了Hsp90抑制剂与DNA聚合酶全酶的直接作用。研究结果得到Hsp90抑制剂17-AAG和AT-533均可以对接在HSV-1 p U_L30/p U_L42结合位点上,表明这两个Hsp90抑制剂可直接作用于HSV-1 DNA聚合酶全酶上并抑制其复合物的形成。总而言之,本研究首次发现Hsp90抑制剂可不通过影响病毒基因转录水平而直接影响病毒DNA的复制,并明确Hsp90可与HSV-1 DNA聚合酶连续性因子p U_L42相互作用,阐明了Hsp90抑制剂可破坏HSV-1 p U_L42稳定性从而通过自噬途径降解来直接调控HSV-1 DNA复制的机制。此外,进一步研究并阐明了Hsp90抑制剂17-AAG和AT-533对HSV-1 DNA聚合酶全酶的直接作用,表明这两个Hsp90抑制剂可直接作用于HSV-1 DNA聚合酶全酶并抑制其复合物的形成。本研究进一步深入阐明了Hsp90抑制剂对HSV-1 DNA复制中的作用机制,针对HSV-1基因组复制阶段开发药物提供了新的研究思路和药物靶标。