目的：　　 气管组织工程技术是近年来气管替代研究的热点，其研究主要包括细胞外基质（生物材料）、种子细胞、再血管化和上皮再生等方面，其中上皮再生是最具挑战性的难题之一。要构建一个有活性的组织工程化气管，其粘膜上皮的功能，尤其是纤毛运动能力是一个必须考虑的问题。Adams等在大鼠气管移植中发现，呼吸道粘膜上皮的覆盖情况与气道闭塞呈负相关，同时在促进与宿主组织结合、防止肉芽组织形成等方面发挥作用。因此，如果能在体外将粘膜上皮覆盖在替代物内表面是很有必要的，缺乏完整的上皮覆盖被认为是疤痕形成和管腔狭窄的重要因素。如何早期地诱导替代物表面的气管粘膜上皮覆盖并恢复其功能，尤其是上皮爬行的速度和纤毛运动的能力是一个必须考虑关键问题。1.大鼠气管上皮在体损伤修复过程中CXCR4的表达。5-FU属抗嘧啶类代谢药，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，可造成细胞周期内细胞的变性坏死，主要作用于S期，对增殖细胞的各期均有作用，但对G0期细胞不敏感。利用5-FU对G0期细胞不造成损伤这一特点,更利于研究处于G0期的干细胞。由于是在体损伤模型，气管血运良好，其修复过程更接近于正常的体内生理过程,而且具有效果容易观察、对细胞损伤作用确切的优点。我们利用此动物模型研究气管损伤修复过程中趋化因子受体CXCR4的表达变化情况。2.CXCR4慢病毒表达载体的构建。以病毒为载体的细胞感染方式具有较高的转染效率，且目的基因在导入靶细胞后在细胞内进行病毒包装扩增，有利于进行基因的功能学研究。慢病毒载体是近几年发展起来的基因工程载体，其最大的特点是能够在体内外转染分裂和非分裂的细胞，是一种具有自我失活功能、无免疫反应的高效的基因传递工具，并且具有容纳外源性目的基因片段大、宿主范围广泛、重组机会低、可将所携带的目的基因整合到宿主染色体中并稳定长期表达并随亲本的繁殖将外源基因传递给子代发挥作用等优。本实验用四质粒感染包装细胞产毒并完成滴度测定，为进一步实验奠定基础。3.CXCR4慢病毒侵染大鼠气管上皮细胞后的表达。CXCR4是介导SDF-1行使功能的GTP蛋白耦联的跨膜受体(GPCR)，其不仅表达于细胞表面，也可在胞浆中检测到，属于G蛋白耦连受体家族，广泛地表达在许多组织和器官上，其主要功能性表达细胞为嗜中性细胞、单核-巨噬细胞。近年来骨髓干细胞、神经细胞、肌细胞、肿瘤细胞的表达研究是其研究热点，气管上皮细胞的表达研究未见报道。4.转染CXCR4基因对气管上皮细胞向SDF-1趋化迁移和增殖作用的研究。SDF-1和其受体CXCR4广泛地、组成性地表达于各种细胞和组织中，二者相互作用引起细胞的骨架重构、牢固地黏附于内皮细胞和定向迁移，并能介导各种特定的信号以产生各种不同的生理和病理效应。近年来有关于SDF-1/ CXCR4轴通过干细胞迁移修复受损病灶的报道逐渐增多，如在缺血的脑组织、心肌组织、肢体肌肉组织中，趋化因子SDF-1明显升高，促使成体干细胞定向迁移至病灶内，加速受损组织的修复再生。有关基质细胞衍生因子SDF-1及受体CXCR4在气管上皮损伤修复的研究报道很少。我们在用自体肺组织瓣完成气管替代的动物实验基础上，想一步了解SDF-1/CXCR4通路在气管上皮细胞修复、迁移、增殖中作用。　　 方法：　　 1.SD大鼠16只，按0.12mg/g用量腹腔注射氯胺酮，颈部切口暴露气管，于气管的3、6、9点滴注药物，对照组PBS200ul，实验组5-氟尿嘧啶100ul。30min后，生理盐水冲洗气管，切取2个气管环作为0h标本。计时并缝合伤口。设3、6、12、24、48h时间点，每个时间点切取气管环。常规HE染色和免疫组化法观察CXCR4表达变化。2.从含有CXCR4基因的质粒克隆模板中，利用PCR方法克隆目的基因，将目的基因纯化后与克隆载体pGEM-T进行连接，选择酶切鉴定和测序正确的克隆进行双酶切(AgeI+EcoRI)、纯化定向连接或者重组到表达载体上，其产物转化细菌感受态细胞，对长出的克隆进行酶切鉴定，证明目的基因已经连入到表达载体上。将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提。四质粒转染293T细胞:FUGW-CXCR4、VSVG、RSV-REV、pMDLg/RRE，收获含病毒的上清贮存。3.联合胰酶和Dispase酶法分离、培养大鼠原代气管上皮细胞，扫描电镜鉴定。免疫荧光法和流式细胞仪检测在气管上皮细胞CXCR4的表达情况和表达强度。CXCR4慢病毒侵染气管上皮细胞，免疫荧光、流式细胞仪、Real TimePCR和Western检测其表达情况。4.利用Transwell趋化实验、MTT细胞增殖实验来测定SDF-1/CXCR-4轴对于介导CXCR4基因转染后的定向趋化和增殖作用。通过测定侵染后细胞的胞内钙流变化检测CXCR4对SDF-1和其抑制剂AMD3100的活化状态。　　 结果：　　 1.实验大鼠均存活48h，完成实验后处死，无实验中死亡。实验组:5-FU作用3h后，气管环上皮细胞开始脱落，光镜下假复层纤毛柱状上皮局部脱落，暴露出基底膜;12h后气管环的上皮全部脱落，残留间隔分布的类似裸核的细胞，呈钉状位于基底膜上。去除5-FU后6h，细胞数目逐渐增多，大部分为扁平状，随着恢复时间延长至12h，上皮细胞由扁平渐变为立方状。恢复24h，上皮细胞呈立方状，并连接成片;恢复48h，气管上皮接近恢复假复层结构。对照组:各时间段的气管环经显微镜下观察，纤毛摆动良好，光镜下未见异常。免疫组化结果显示:(1)正常气管粘膜上皮的CXCR4表达较低。(2)气管上皮损伤后修复的早、中和后期的气管上皮细胞中CXCR4的表达较低。2.根据Genebank(GeneID:2735718)，CXCR4基因编码区长度1100bp。电泳图见PCR产物中扩增出相同大小目的基因条带。酶切阳性克隆和表达载体均可见目的基因条带，CXCR4基因成功包装到慢病毒载体。3.分离的气管上皮细胞为圆形，折光度好，4,5d后细胞增殖，形成片状的细胞团。扫描电镜放大可见特异性纤毛由细胞顶膜伸出，部分集结成束，为气管纤毛上皮细胞。免疫荧光结果显示:细胞膜表面未检测到明显的绿色的FITC标记，表明细胞膜上CXCR4表达非常低。流式细胞仪检测有3％的细胞中CXCR4蛋白质有一定强度的表达。CXCR4慢病毒侵染气管上皮细胞后，病毒包装效率较高。同时，获得的慢病毒上清可高效感染气管上皮细胞，荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光，感染效率为50％左右。感染后靶细胞中CXCR4有稳定高表达，RT-PCR显示CXCR4溶解曲线和扩增曲线显示峰值较高，形状比较锐利，曲线斜率较大，说明CXCR4表达量较高，产物比较特异，扩增效率较高。4.MTT实验结果显示随着SDF-1浓度增加，两组的吸光度值都增加。当SDF-1浓度大于100nM时，转染CXCR4的细胞较正常细胞增加更显著，P＜0.05。Transwell实验显示从上室迁移至下室的细胞数随着SDF-1浓度的增加而增加，在SDF-1100nm时，增加的数量更显著。从反应曲线看，随着浓度增加，SDF-1对细胞内钙流的释放有明显的促进作用;CXCR4受体拮抗剂AMD3100对气管上皮细胞内的钙流的释放有明显的抑制作用。　　 结论：　　 1.通过成功构建的在体气管损伤、修复的动物模型，观察了气管上皮细胞修复过程中CXCR4的表达情况。CXCR4被认为是一种新的干细胞表面标记物，气管干细胞的研究尚处于起始阶段。本实验常规的免疫组化方法结果显示:正常气管粘膜上皮的CXCR4表达较低;气管上皮损伤后修复的早、中和后期的气管上皮细胞中CXCR4表达也没有明显增加。其原因可能有:(1)正常气管上皮的CXCR4基础表达较低，损伤修复过程中亦没有出现高表达。(2)气管上皮细胞中的干细胞的含量也较低。(3)CXCR4是跨膜蛋白受体，主要在细胞膜表达，本实验使用的常规的免疫组化方法或抗体不能检测或真实反映气管上皮的CXCR4表达情况，应该从rnRNA水平或蛋白表达水平检测其表达情况。　　 2.慢病毒载体是近几年发展起来的基因工程载体，其最大的特点是能够在体内外转染分裂和非分裂的细胞，是一种具有自我失活功能、无免疫反应的高效的基因传递工具，具有容纳外源性目的基因片段大、宿主范围广泛、重组机会低、可将所携带的目的基因整合到宿主染色体中并稳定长期表达，并随亲本的繁殖将外源基因传递给子代发挥作用等优点。本实验用四质粒感染包装细胞产毒并完成滴度测定，为进一步实验奠定基础。　　 3.气管上皮是假复层纤毛柱状上皮，仅有一层细胞，通过两种酶的联合消化法，克服各自的缺点，所得的细胞状态好，细胞的贴壁和增值都较强，并通过扫描电镜鉴定，观察到了气管上皮细胞特征性的纤毛结构，成功地培养了气管上皮细胞并完成了传代，为下一步的细胞水平研究奠定了基础。气管上皮细胞的CXCR4表达研究较少，通过本实验的免疫荧光和流式细胞仪检测，气管上皮细胞膜的CXCR4表达和含量非常低，不是其主要的功能细胞，也可能随着体外的培养而降低了表达。通过慢病毒侵染后，CXCR4产物比较特异，表达含量明显增高。慢病毒包装系统操作比较简单，转染成功率高，稳定性好。　　 4.正常情况下，仅少量气管上皮表达CXCR-4受体。有研究发现在肺组织损伤的微环境中，SDF-1表达明显增高。研究表明，转染CXCR4的细胞可以顺SDF-1浓度而梯度迁移运动，细胞的活力也得到增加。通过基因工程将气管上皮细胞转染趋化因子SDF-1的受体CXCR-4，有望加快气管上皮细胞向SDF-1增高的损伤部位趋化和修复的目的。此研究为肺组织瓣替代气管的研究提供了理论基础研究，为更好地诱导气管上皮在肺组织瓣表面的爬行再生提供新的方法。