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H3N2犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)是一种由禽流感病毒跨宿主传染至犬,可在犬间迅速传播的传染性呼吸道病毒,在亚洲多国以及美国的犬中广泛流行,易伴随继发性感染,对犬的健康造成极大危害。实验室前期研究发现两株在鼠上复制能力完全不同的毒株:一株禽源H3N2 CIV(A/canine/Zhejiang/01/2012)(简称为ZJ01),鼠上复制良好,但无法感染禽;一株H3N2禽流感病毒(A/chicken/Shanghai/D6/2012)(简称为SHD6),不感染小鼠。ZJ01-PB2被SHD6-PB2替换后,ZJ01病毒无法成功拯救;反之,将ZJ01-PB2替换到SHD6毒株之后,SHD6在鼠上复制能力从不感染变为复制良好。本研究重点阐明PB2对ZJ01病毒在哺乳动物中的适应性及作用机制。分别以ZJ01和SHD6为背景,通过聚合酶活性实验测定单、双基因替换后的聚合酶活性,结果显示,ZJ01-PB2是影响ZJ01病毒株聚合酶活性的关键基因。通过替换PB2基因的五个功能区测定聚合酶活性,结果发现,ZJ01 PB2蛋白的627-domain对聚合酶活性具有重要作用。对比ZJ01和SHD6的627-domain发现存在4个不同的氨基酸位点,通过单点突变测定聚合酶活性,结果表明,PB2蛋白576E可显著上调ZJ01和SHD6病毒的聚合酶活性,表明位于627-domain的576氨基酸位点是影响聚合酶活性的关键氨基酸位点。为验证PB2蛋白576E对ZJ01病毒复制的作用,通过反向遗传操作系统拯救到四株病毒:r-ZJ01、r-ZJ01-PB2-E576K、r-SHD6和r-SHD6-PB2-K576E。鼠的感染实验结果显示,与同背景下的病毒株r-ZJ01-PB2-E576K或r-SHD6-PB2相比,PB2蛋白携带576E的毒株r-ZJ01和r-SHD6-PB2-K576E在鼠上的复制能力显著提高。同时,通过测定r-ZJ01、r-ZJ01-PB2-E576K、r-SHD6和r-SHD6-PB2-K576E在不同宿主细胞(MDCK和CEF)中的生长曲线,结果表明,PB2蛋白576E可显著提高r-ZJ01或r-SHD6在MDCK上的复制能力,但PB2-576E/K对r-ZJ01或r-SHD6在CEF上复制能力无明显作用。这些结果表明,PB2-576E是影响ZJ01病毒株在哺乳动物细胞MDCK上复制的关键氨基酸位点。现有的研究表明宿主蛋白ANP32A可与流感病毒PB2蛋白627-domain互作从而调控流感病毒聚合酶活性。为鉴定PB2蛋白576E与宿主蛋白ANP32A是否存在互作,通过CO-IP实验进行了鉴定,结果显示,携带576E的PB2蛋白与不同宿主ANP32A的相互作用显著强于PB2-576K。进一步地,测定过表达不同宿主蛋白ANP32A对ZJ01和SHD6聚合酶活性的影响,结果表明,PB2-E576K使ZJ01的聚合酶活性显著下降,且过表达人或犬的ANP32A不能使ZJ01-PB2-E576K和SHD6的聚合酶活性升高。以上结果表明,哺乳动物源ANP32A只能识别PB2-576E,从而使得犬流感病毒ZJ01在哺乳动物细胞中具有较高的聚合酶活性。进一步说明PB2-576E与哺乳动物源ANP32A互作是上调ZJ01聚合酶活性的必要条件。综合上述,PB2-576E通过与宿主蛋白ANP32A互作调控ZJ01病毒在哺乳动物中的聚合酶活性,从而使该病毒在哺乳动物中具有较强的复制能力,为今后深入理解H3N2 CIV在哺乳动物的复制与适应机制奠定了基础。