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目的膝关节软骨损伤的治疗一直是个难题,软骨组织工程为关节软骨损伤治疗提供了新的策略。脂肪源性干细胞(ADSCs)具有来源丰富、取材容易、增殖迅速等优点,在软骨的再生修复中显示出广阔的应用前景。然而,如何诱导ADSCs高效的向软骨细胞分化,仍是一个有待解决的问题。FGF信号通路在软骨细胞的基质代谢中发挥重要作用。本研究首先利用Pellet模型,考察FGF-18对ADSCs成软骨分化的影响,以及FGF-18和TGF-β3双因子体系对ADSCs软骨分化可能存在的诱导作用。同时比较无支架的Pellet培养和纤维蛋白凝胶支架两种培养方式成软骨效果的差异。从细胞因子和培养模式两方面,总结出一种可高效诱导ADSCs体外成软骨分化的培养体系,为下一步体外高效构建组织工程软骨提供理论依据。方法1、分离提取人ADSCs,取P3代ADSCs进行细胞微团培养(Pellet培养),每个pellet中含ADSCs5×105,实验分组:对照组,TGF-β3组,FGF-18组及双因子组。另取部分细胞流式分析鉴定表面分子。Pellet体系诱导培养5周,进行冰冻切片和相关病理学染色:苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色、番红O染色和天狼星红染色,分析各组ADSCs成软骨分化情况。测定1、2、3、4周不同时间点Pellet的GAG和DNA含量。荧光定量PCR检测培养第5周软骨相关的基因表达情况。2、利用Pellet培养和纤维蛋白凝胶支架两种培养体系将P3代ADSCs诱导成软骨,每个培养体系为5x105个细胞,21天后取材进行苏木精-伊红染色,番红O染色,DMMB法测定胞外基质中GAG含量,荧光定量PCR测定Ⅱ型胶原基因表达。结果1、流式细胞分析结果为CD14-CD34-CD73-CD90+CD105+CD166+,表明分离的ADSCs表达干细胞标志分子。病理学染色和GAG测定结果显示,与阳性对照TGF-β3组类似,FGF-18组能有效诱导ADSCs成软骨分化,并且FGF-18和TGF-β3双因子体系能协同促进软骨细胞外基质的合成。荧光定量PCR结果显示,FGF-18和TGF-β3均能促进软骨细胞标志基因Aggrecan、Col2a1、Sox9及COMP的表达,FGF-18和TGF-β3双因子能协同促进ADSCs表达上述软骨相关标志基因。Col10是软骨肥大化的标志分子,应用FGF-18和TGF-β3均提高了Col10的表达,双因子组Col10的表达最高,说明在Pellet模型中ADSCs仍有向纤维软骨分化的倾向。2、苏木精-伊红染色与番红-O染色显示,纤维蛋白凝胶实验组软骨细胞外基质大量分泌,并融合成片,说明纤维蛋白凝胶支架可更好促进干细胞成软骨分化、维持软骨细胞表型。GAG/DNA结果显示,纤维蛋白凝胶组促GAG分泌的能力优于其余各组(P<0.05),其Ⅱ型胶原m RNA表达的能力也最强(P<0.05)。结论我们成功建立了人ADSCs的分离培养体系,利用Pellet三维诱导培养体系,发现FGF-18能显著促进ADSCs的成软骨分化,诱导能力与TGF-β3类似,而双因子体系即FGF-18和TGF-β3联合应用能显著促进ADSCs向软骨分化;在改良的纤维蛋白凝胶中,添加TGF-β3诱导因子,可成功诱导人ADSCs向软骨分化,构建软骨样组织,且利用纤维蛋白凝胶支架诱导人脂肪干细胞成软骨分化的能力优于无支架的单纯Pellet培养,所形成的软骨组织在功能与结构上更接近天然软骨。我们的研究结果对于ADSCs在软骨组织工程及软骨修复中的应用有重要的价值。