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磷是植物生长发育所需的大量营养元素,对植物的光合、呼吸、抗逆、产量和品质性状有着重要影响。虽然多数土壤中总磷含量都不低,但有效磷缺乏,多数土壤中仅有2μmol/L,己成为世界作物的重要限制因子之一。为了降低磷缺乏对植株生长发育的影响,确保产量和品质,全世界每年要施用约3500万t的磷肥,其中80%被酸性土壤中的铁/铝氧化物及石灰性土壤中的碳酸钙化合物所固定,使土壤中有效磷的含量只有全磷含量的1/200~1/500。不同的作物和作物品种对低磷土壤的适应能力存在差异,仅有少数作物和作物品种吸收和利用磷素的能力较强。因此,筛选磷高效基因型品种,提高作物对土壤中储备态磷的利用效率,对于减少磷肥消费量和保护农业生态环境具有重要意义。
甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC,2n=4x=38)是世界上的第二大油料作物,也是我国五大油料作物之首。但它对磷缺乏很敏感,并表现出基因型差异。长江流域是我国油菜的主产区,也是世界上最大的油菜生产带,油菜种植面积和总产量均占全国的80%以上。但是由于该地区土壤偏酸,储备态磷富集比较严重,导致有效磷缺乏,准确筛选磷高效基因型材料,提高油菜对磷的利用效率成为解决这一问题的关键。
甘蓝型油菜是由芸薹属二倍体物种白菜(Brassicarapa,AA,2n=2x=20)和甘蓝(Brassicaoleracea,CC,2n=2x=18)通过天然种间杂交后再加倍而形成的异源四倍体物种。此外,近年来关于同为十字花科的模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)与芸薹属的比较基因组学研究表明,芸薹族祖先曾发生了基因组水平的三倍化,即白菜、甘蓝等芸薹属现代二倍体物种由一个六倍体的芸薹族祖先衍化而来。基于该三倍化假说,一般推测在芸薹属二倍体物种存在约3个垂直同源基因与拟南芥的单个基因相对应,而甘蓝型油菜与拟南芥间的这种对应关系就为6∶1。不过,上述属内种间以及属间进化关系的确立,过去主要是基于分子标记和传统进化手段来进行研究,尚缺乏基于不同物种间基因家族克隆的功能比较基因组学研究的证据的支撑。
酸性磷酸酶(APase,EC3.1.3.2)广泛存在于植物体内,在pH4~7范围内能催化水解有机磷为无机磷(Pi)。植物在遭受磷饥饿胁迫时,APases分泌增加,分解细胞外有机磷化合物,释放出Pi,供植物吸收和利用。拟南芥的44个APases中,有29个为紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatases,PAPs),其中AtPAP12和AtPAP17已被证明与拟南芥适应磷饥饿密切相关。
本研究引入了TOPSIS综合分析方法,对苗期与磷营养相关的8个形态和生理指标进行综合排序分析,并结合田间试验结果,对甘蓝型油菜磷高效基因型品系进行了筛选,获得了磷高效利用基因型品系W17。以磷饥饿处理的W17的组织器官为材料,本研究利用RACE技术,克隆了甘蓝型油菜PAP12基因家族和PAP17基因家族的主要基因成员的全长cDNA和基因组序列,通过生物信息学分析、RT-PCR和原核表达等研究初步明确了它们的功能。此外,本研究还克隆了亲本物种白菜和甘蓝中PAP12家族和PAP17家族的基因组序列,通过它们与甘蓝型油菜间基因和蛋白水平的生物信息学和分子进化研究,结合Southern杂交的比较,为研究这3个物种间以及它们与拟南芥间的关系提供了功能比较基因组学的证据,也揭示了PAP12家族和PAP17家族一些重要的分子进化特征。主要研究结果如下:
1.利用TOPSIS法筛选出典型的磷高效甘蓝型油菜品系W17;
2.克隆了甘蓝型油菜及其本物种PAP12和PAP17基因家族主要成员;
3.揭示了芸薹属PAP12和PAP17基因家族的一些结构特征
4.揭示了白菜-甘蓝及高度近缘种中新进化的MMTS,它在转座子与基因(组)进化关系和物种进化等研究中具有重要价值;
5.部分同源的非等位基因间的交换参与了芸薹属基因(组)的进化;
6.PAP12和PAP17家族成员的种间对应关系进一步说明甘蓝型油菜的确为白菜和甘蓝的融合体;
7.揭示了芸薹属PAP12和PAP17基因家族的密码子进化特点;
8.芸薹属PAP12和PAP17家族分别编码HMW PAP和LMW PAP活性蛋白;
9.BnPAP12和BnPAP17基因家族均受磷饥饿诱导,且成员间表达特性的分化明显。