论文部分内容阅读
Op18是一种重要的细胞信号转导分子,该蛋白在细胞分化、组织再生、修复及发育中,尤其是在恶性肿瘤的发生、发展及决定表型上具有重要作用及意义,该基因及其表达产物是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点。但是,op18在肿瘤组织中过表达的调控机制尚未阐明。核转录因子E2F对细胞周期的调控至关重要,研究显示,op18基因启动子上存在E2F的结合位点,说明op18是转录因子E2F调控的靶基因。本实验旨在探讨转录因子E2F对op18基因的调控机制及对肿瘤细胞生物学行为的效应机制,从而为肿瘤的生物治疗寻找新的技术方法。目的:设计合成转录因子E2F哑铃形圈套寡核苷酸（Decoy ODNs圈套寡核苷酸）并构建肿瘤特异性survivin启动子调控的E2F1 siRNA逆转录病毒载体,探讨转录因子E2F对肿瘤细胞而非正常细胞中op18基因调控机理及对肿瘤细胞增殖的影响。方法:（1）将体外设计合成的哑铃形圈套寡核苷酸在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下转染肿瘤细胞（MKN-45细胞和A549细胞）,用RT-PCR检测转染细胞中op18 mRNA表达水平,通过MTT实验观察转染细胞的生长抑制情况,TUNEL法观察转染细胞凋亡情况。（2）利用重组DNA技术,将survivin启动子和E2F1 siRNA基因序列亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pLXSN/Surp/E1在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人肺癌细胞A549,G418筛选出抗性克隆,命名为A549/E1,利用PCR对A549/E1细胞进行鉴定重组逆转录病毒是否整合到A549/E1细胞基因组中。（3）用RT-PCR及Western blot法鉴定A549/E1细胞中op18表达。（4）测定细胞增殖曲线观察细胞增殖情况,流式细胞仪技术（FCM）分析转导后细胞凋亡情况。结果:（1）哑铃形圈套寡核苷酸被成功转染入肿瘤细胞（MKN-45细胞和A549细胞）,RT-PCR检测发现哑铃形圈套寡核苷酸处理后的肿瘤细胞中op18 mRNA表达水平明显低于对照组,MTT实验显示转染细胞增殖速度下降而空白对照组无明显变化,TUNEL凋亡染色可见凋亡细胞。（2）测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定显示,成功构建肿瘤特异性survivin启动子调控的E2F1 siRNA的逆转录病毒表达载体;获得高滴度产毒细胞株C28,滴度为2.0×106/ml,重组病毒感染的A549细胞PCR分析证明目的基因已整合至A549/E1细胞基因组中;RT-PCR、Western blot法鉴定A549/E1细胞中op18表达明显下调;A549/ E1细胞与A549/0细胞、未感染的A549细胞比较,A549/E1生长速度显著被抑制;流式细胞仪技术（FCM）分析显示A549/E1细胞调亡明显增加。结论:哑铃形圈套寡核苷酸能特异性抑制E2F转录因子对op18基因的转录调控,进而抑制op18基因表达及肿瘤细胞增殖;成功构建的由肿瘤特异性survivin启动子调控的E2F1 siRNA逆转录病毒,能有效地沉默肿瘤细胞中转录因子E2F1,进而影响op18基因的转录调控,使op18基因表达下调而对正常细胞无影响,因此,我们的试验为开发以E2F1及其下游调控基因op18为靶点的生物治疗新模式奠定实验基础。