腺样囊性癌一个重要特点是嗜神经侵袭,进而引起感觉异常、麻木和疼痛,若侵犯面神经还可引起面神经麻痹。肿瘤细胞可沿着神经浸润相当的距离,甚至远远超出临床上可见的肿瘤边界,切除不足易造成局部复发。自从发现肿瘤的嗜神经侵袭现象以来,其发生的病理机制一直是人们研究的热点,但是研究进展相对比较缓慢,一个重要原因就是对于嗜神经侵袭现象缺少有效的体内体外模型。本研究尝试将腺样囊性癌细胞与小鼠背根神经节细胞进行三维共培养,在体外观察腺样囊性癌嗜神经侵袭的发生过程,并通过该模型探讨腺样囊性癌细胞在与神经组织的相互作用过程中癌细胞生物学特性和基因表达谱的改变。已有研究表明,轴突引导分子Eph受体在神经系统的发育过程中,参与了神经轴突的生长、调节及其与所支配组织的正确连接等一系列精确复杂的过程。最近发现,这类分子在神经系统以外也有广泛表达,可以参与肿瘤发生及肿瘤血管生成。鉴于轴突引导分子Eph受体在神经系统发育调节、肿瘤发生与血管生成方面发挥的作用,我们将EphA2受体及其配体ephrinAl应用于腺样囊性癌的研究,一方面揭示轴突引导分子EphA2在腺样囊性癌中的作用,另一方面希望能发现该轴突引导分子与腺样囊性癌嗜神经侵袭的可能关系。第一部分腺样囊性癌嗜神经侵袭体外模型的建立目的：建立一种腺样囊性癌嗜神经侵袭的体外研究模型。方法：将腺样囊性癌细胞系ACC-M(1×104个细胞／孔)与小鼠背根神经节在基质胶中进行共培养,采用倒置相差显微镜和荧光双染动态观察肿瘤细胞与神经轴突的相互作用过程。结果：ACC-M细胞与小鼠背根神经节在共培养的第一天可见神经轴突从背根神经节组织周围伸出；约在第三天可见神经轴突与腺样囊性癌细胞发生接触,随后肿瘤细胞会沿着神经轴突向神经节方向增殖生长,类似于体内的嗜神经侵袭；被肿瘤细胞侵袭的神经轴突不再继续增长,而没有与肿瘤细胞接触的神经轴突则可以继续向远处生长。共培养中的腺样囊性癌细胞的克隆生长面积比单独培养的肿瘤细胞显著增大。结论：腺样囊性癌-背根神经节共培养能够模拟癌细胞嗜神经侵袭的发生过程,对于研究腺样囊性癌嗜神经侵袭的分子机制具有重要价值。第二部分神经微环境对腺样囊性癌细胞侵袭、生存能力及基因表达的影响目的：分析腺样囊性癌嗜神经侵袭与临床病理参数的关系以及侵袭神经的肿瘤细胞与远离神经部位的肿瘤细胞在增殖与凋亡方面的差异；体外观察腺样囊性癌细胞-小鼠背根神经节共培养对腺样囊性癌细胞粘附、侵袭及生存能力的影响；分析腺样囊性癌细胞ACC-M与背根神经节共培养后基因表达的改变。方法：采用免疫组化染色和TUNEL试验,分别检测32例腺样囊性癌组织标本中S-100、Ki-67表达及细胞凋亡的变化,分析嗜神经侵袭的发生率与临床病理因素的关系,比较侵袭神经的肿瘤细胞与远离神经部位的肿瘤细胞在增殖与凋亡方面的差异。在间接共培养或条件培养基刺激下,采用Transwell试验、Ki-67染色、MTT、TUNEL试验检测腺样囊性癌细胞侵袭能力及生存能力的改变化。应用基因芯片分析共培养组和对照组的基因表达差异。结果：32例腺样囊性癌中有25例(78.1%)发生了嗜神经侵袭,未发现腺样囊性癌的解剖部位及肿瘤大小与嗜神经侵袭现象有关,但与组织分型有关,管状型发生率较低。通过侵犯神经的肿瘤细胞与远离神经的肿瘤细胞对比,我们发现神经周围的肿瘤细胞的增殖能力增强、凋亡减少(p<0.05)。条件培养基可以增加肿瘤细胞对脑组织的粘附能力,但是统计结果未存在显著的差异。腺样囊性癌细胞与背根神经节共培养可以间接刺激并增强肿瘤细胞的侵袭能力(p<0.05)。在腺样囊性癌细胞与背根神经节的相互作用的间接刺激下,腺样囊性癌细胞的增殖能力显著增强,凋亡显著减少(p<0.05)。MTT试验显示腺样囊性癌细胞与背根神经节相互作用可以刺激腺样囊性癌细胞的生长。通过基因芯片筛选出369个表达上调的基因和920个表达下调的基因。结论：嗜神经侵袭的发生率与腺样囊性癌的病理类型密切相关。在腺样囊性癌与神经相互作用过程中,肿瘤细胞获得了侵袭能力的增强与生存能力的增强。而腺样囊性癌细胞与神经相互作用后基因表达的改变可能是其嗜神经侵袭发生的分子基础。第三部分EphA2/ephrin Al在腺样囊性癌嗜神经侵袭中的作用研究目的：研究EphA2/ephrin Al在腺样囊性癌中的表达与功能及其与嗜神经侵袭的关系。方法：免疫组化检测32例腺样囊性癌组织中EphA2和ephrinAl的表达,分析其与临床病理指标的关系。通过Western Blot和qRT-PCR,检测腺样囊性癌细胞系及组织中EphA2和ephrinAl在蛋白和mRNA水平表达的差异。通过免疫共沉淀技术检测腺样囊性癌细胞系中EphA2受体的磷酸化水平。应用重组EphA2-Fc因子和ephrinAl-Fc因子,观察在激活和阻断EphA2受体功能时腺样囊性癌细胞的生物学行为改变以及EphA2信号对腺样囊性癌细胞侵袭神经组织的影响。结果：在32例腺样囊性癌组织中EphA2高表达占71.9%(23／32),ephrinAl高表达96.9%(31／32),相对于正常唾液腺组织表达增强(p<0.05)。通过与临床病理指标的相关性分析发现EphA2/ephrinA1的高表达与腺样囊性癌的嗜神经侵袭相关。通过Weatern blot和Realtime RT-PCR分析,EphA2/ephrinAl在蛋白水平和mRNA水平均表达上调。在腺样囊性癌组织和细胞中EphA2受体磷酸化程度与其表达程度相反,呈低磷酸化状态。EphrinA1-Fc可以减弱腺样囊性癌细胞的增殖活性和迁移能力。EphA2-Fc可以抑制神经细胞向肿瘤细胞运动,并且在共培养体外模型中可抑制轴突生长。结论：EphA2/ephrinAl在腺样囊性癌中高表达,并可影响腺样囊性癌细胞的活性和侵袭能力,EphA2-Fc可抑制腺样囊性癌细胞与神经之间的相互作用。