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前言 2001年，McIntire等通过基因定位克隆技术发现了一个鼠的新的基因家族，命名为T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomainprotein，Tim)家族。Tim-1是Tim家族中第一个被发现的成员。在激活的Th2细胞表面呈高水平表达，此外在树突状细胞、Th1细胞、Th17细胞、肥大细胞、肾管状上皮细胞以及自然杀伤细胞表面也有少量或低水平表达。 Tim-1作为一个重要的免疫调节分子，在免疫应答和免疫调节中发挥重要作用:(1)Tim-1作为协同刺激受体促进Th2细胞分化、增殖和细胞因子分泌，增强Th2应答;(2)Tim-1粘蛋白区在维持调节性B细胞分泌IL-10水平和自身免疫耐受中发挥了一定作用，缺乏粘蛋白区的小鼠更易获自身免疫病;(3)Tim-1表达于树突细胞，被Tim-1信号激活的树突细胞可以促进T细胞的应答;(4)Tim-1在健康成熟的肾脏不表达或表达很低，而在急性缺血性或中毒性肾脏损伤时，近曲小管上皮细胞Tim-1的表达明显上调，此种上调反映了近端肾小管上皮细胞的分化、间质纤维化和炎症浸润。同时，Tim-1基因多态性与气道高反应性(AHR)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘(Asthma)、多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(RA)等多种自身免疫病有着密不可分的关系。 我们此前对系统性红斑狼疮模型鼠NZBxNZWF1小鼠狼疮肾炎遗传因素的研究发现，其亲代新西兰白鼠(NZW)和新西兰黑鼠(NZB)Tim-1的cDNA序列有所不同。NZB小鼠Tim-1cDNA较NZW小鼠Tim-1cDNA胞浆区序列缺失了793-925共132个碱基。为了了解NZB小鼠Tim-1cDNA序列的此种改变是否与NZB小鼠不易患狼疮肾炎有关，本实验构建携带有NZB、NZW和C57BL/6小鼠Tim-1编码序列的真核表达质粒，为后续研究NZB小鼠Tim-1的功能奠定基础。 实验方法 一、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1cDNA序列的生物信息学分析 用VectorNTI软件的Align功能对NZB、NZW、C57BL/6(参考序列NM_134248.2)小鼠Tim-1的cDNA序列进行比对;用VectorNTI软件的Analysis功能分别对NZB、NZW、C57BL/6（参考序列NM_134248.2）小鼠Tim-1编码蛋白序列的胞浆区进行磷酸化位点分析。 二、携带NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1编码序列的真核表达质粒的构建 （一）NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1基因编码序列(CodingDNASequence，CDS)的扩增 采用巢式PCR的方法，对NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1基因编码序列(CDS)进行扩增。 （二）将PCR产物克隆至pcDNA3.1/myc-hisA真核表达质粒 通过中间媒介T载体，最终将上述PCR产物分别克隆至真核表达质粒pcDNA3.1/myc-hisA。构建成功后进行BamHI和EcoRI双酶切及测序鉴定。 三、携带NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1编码序列的重组真核质粒的表达 将携带NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1编码序列的重组质粒通过阳离子脂质体的方法转染293T和DC2.4细胞，同时设立空质粒组和PMAX-GFP组，转染后流式检测各重组质粒在293T和DC2.4细胞中的表达。 实验结果 1、NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1cDNA的生物信息学分析结果 NZB小鼠Tim-1cDNA较参考序列缺失了793-925位置的共132个碱基，其 中包括了771-773位置的终止密码子TGA，同时925以后的碱基序列向前补充了空缺的位置，并形成了一个以913-915的TAA为终止密码的新的开放读码区(ORF)，这种改变导致其编码蛋白对应于参考序列中293-299位置的酪氨酸激酶磷酸化位点(RAEDNIY)丢失。 2、成功构建携带NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1编码序列的真核表达质粒并在293T和DC2.4细胞中获得成功表达。 结论 1、NZB小鼠Tim-1基因编码区793-925位置碱基缺失，导致其编码蛋白胞浆区对应于参考序列中293-299位置的酪氨酸激酶磷酸化位点(RAEDNIY)的丢失，可能影响Tim-1相应功能。 2、成功构建携带NZB、NZW、C57BL/6小鼠Tim-1编码序列的真核表达质粒。