A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的猪水疱病的病原体,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员。病猪表现食欲不振、嗜睡、厌食并伴有跛行及蹄部病变,新生仔猪发生急性死亡。2015年我国广东省首次暴发SVA疫情,此后在我国湖北、黑龙江、河南、福建、广西、山东、四川和广东等省份陆续发生SVA感染病例,给养猪业造成一定的经济损失。然而,关于SVA的病毒学基础和应用研究还不充分,且市面上也没有相应的疫苗和抗病毒药物。鉴于此,本研究首先通过细胞培养的方法分离出5株SVA,并对分离毒株进行了序列测定及病毒增殖特性鉴定等研究。进一步,利用反向遗传学技术构建出SVA GD05/2107株病毒感染性克隆。然后,将外源基因插入到SVA感染性克隆病毒基因组中,拯救出能够表达外源基因的重组SVA,并进行了相关病毒学特性研究。1.A型塞内卡病毒的分离鉴定及序列测定2017-2018年,广东某些猪场的猪只口蹄部出现水疱、嗜睡、跛行和体温升高等临床症状,1-4日龄仔猪出现一定数量的死亡。为了确诊该疾病的病原,本研究从患病猪只中采集了 20份样品,经RT-PCR检测有5份样品为SVA阳性。将阳性病料分别研磨处理后感染ST-R细胞,进行病毒分离。经RT-PCR、1FA及WB分析鉴定,确认本研究分离得到5株SVA毒株,并将其分别命名为GD01/2017、GD03/2017、GD05/2017、GD06/2017、GD-S1/2018。序列分析显示,本研究分离毒株基因组全长约7.2 kb,由5’UTR、3’UTR带有PolyA及编码一个2181 aa多聚蛋白的开放阅读框组成。遗传系统发生树显示,SVA中国分离株主要形成9个分支,其中本研究分离的5个毒株位于Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ分支上,揭示了 SVA中国分离株的进化多样性。2.GD05/2017株全长感染性克隆的构建及病毒拯救利用反向遗传学技术,构建SVA GD05/2017株病毒感染性克隆。依次利用酶切连接和同源重组方法将病毒全长基因组片段插入到pEGFP-C3载体中,得到该毒株的全长cDNA克隆质粒pC3-SVA-GD05。将pC3-SVA-GD05转染BHK-21细胞,3 d后再取上清接种ST-R细胞,60-72 h后收获病毒液。用RT-PCR、IFA及WB检测,结果表明成功拯救SVA感染性克隆病毒,并将其命名为V-GD05-clone。3.构建表达报告基因的重组SVA为了能够快速且直观地检测病毒在细胞上的生长情况,本研究将3种不同大小的外源基因分别插入SVA感染性克隆病毒基因组中,并成功拯救出能够表达外源基因的感染性克隆病毒V-GD05-iLOV、V-GD05-RFP、V-GD05-Nluc。报告病毒的遗传稳定性分析显示,V-GD05-iLOV能够在细胞上维持最高水平的稳定传代,而V-GD05-RFP、V-GD05-Nluc传至3-5代后,报告基因出现大量的缺失,表明外源基因在病毒基因组中不稳定。IFA及流式细胞术结果显示,V-GD05-iLOV感染细胞能检测到中等强度的荧光信号,V-GD05-RFP感染细胞能检测到高等强度的荧光信号;荧光素酶活性测定显示,V-GD05-Nluc可通过检测荧光素酶活性来定量检测病毒的复制水平。同时,本研究将三种SVA报告病毒感染ST-R ANTXR1 KO细胞系,初步证明了 ANTXR1是SVA入侵猪源细胞的受体,为后续病毒与受体相互作用的研究奠定了良好的基础。