线虫的结构简单,生命周期短,繁殖力强,其基因组已全部完成测序等,这些优势使其成为生命科学研究中广泛应用的模式生物。与其他模式生物相比,它的神经系统也是最简单的:雌雄同体成虫的302个神经元可以简单划分为中间神经元、感觉神经元和运动神经元等几大类。本研究以线虫的神经系统为模型,拟在确定各个神经元的位置,为研究各个神经元在线虫神经回路中的功能做基础。虽然有很多种技术可以用于线虫的活体定位,但可以实现线虫单神经元定位的却屈指可数,主要因为线虫基因广泛的表达谱,能用来定于到单个神经元的启动子数量很有限。鉴于此,本研究拟采用结合FLP/FRT,Cre/LoxP和R/RS等位点特异性重组系统的分子生物学方法,结合激光共聚焦显微成像技术,来确定能特异性驱动荧光蛋白在特定神经元表达的启动子或者启动子组合,从而为构建数字线虫打下基础。　　此外,我们在标记线虫特定神经元的过程中,通过不断的探索和实验验证,发现了一些便捷有力的载体构建技术,其中in-fusion技术和Multisitegateway技术的结合,既体现了in-fusion技术高效、彻底无缝连接的优势,也将Multisitegateway技术中反应元件可以反复使用的优势发挥到极致。同时也期待在进一步的实验中将这些技术方法应用于线虫基因的条件性诱导表达,从而可以很方便的研究引起线虫行为学特点的某个基因在神经回路中的作用。在准确定位神经元后,可以使光控蛋白(Channelrhodopsin-2,ChR2;Natronomonaspharaonishalorhodopsin,NpHR)、钙调蛋白(GFP-CalmodulinProtein,G-CaMP,GFP-Greenflurescingindicator,G-GECO)等特异表达于目标神经元,进而研究神经元在整个神经回路中的功能。　　“单个启动子驱动多个基因的同时表达”也被称作多顺反子表达。但目前在线虫体内可以广泛采用的多顺反子表达载体主要是基于线虫的第二类反式剪接机制中的splicedleader(SL2),这种方法因为SL2的亚型(SL2a,SL2d,SL2e)在介导多基因同时表达时偶尔会有基因的乱表达情况而使其作用受到些许限制。在本课题中,我们发展了线虫的多顺反子表达系统,这个系统是基于2A自剪肽类(self-cleaving2Apeptide,2A)的表达载体,它是在一个阅读框内以不依赖于终止子的方式实现多个蛋白的独立表达。这类表达载体的效率已在斑马鱼、小鼠和体外细胞培养中得到验证,我们采用P2A(porcineteschovirus-12A,来自于猪的口蹄疫病毒的2A)来确定它是否能在线虫体内介导多顺反子的同时表达,实验数据初步显示,2A系统介导的多顺反子表达载体能够在线虫体内正常表达,从而为今后多顺反子表达载体的构建提供新的思路。