论文部分内容阅读
转录调控是各项生命活动的基础,探究其内在的分子机制是当今生命科学研究的核心问题,具有重要的意义。全面测定转录调控过程中涉及的多种蛋白质-核酸以及蛋白-蛋白之间的相互作用,是揭示复杂调控机制的关键。现行的各种针对于蛋白质-核酸互作与蛋白-蛋白互作的检测技术,均有其独特的优势及应用范围。但是由于核酸与蛋白质基本检测原理的不同,其检测体系是相互独立的,具有不兼容性,即不能在一个相同的体系里面,同时平行检测蛋白互作以及蛋白核酸互作。采用现有方法研究转录调控时,往往会将蛋白质-核酸互作与蛋白-蛋白互作割裂开研究,故而无法获得完整的反应内在真实情况的信息,在构建多组分转录调控网络时存在一定的局限性。因此建立新的兼容性互作检测方法十分必要,这样有助于深入理解转录调控机理,具有广泛的意义。论文以此为出发点,基于cDNA展示与邻近连接技术,设计并建立测定转录调控复合物的One-Pot-seq方法,实现蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作在同一实验体系中的平行测定。One-Pot-seq方法主要分为三部分,即采用cDNA展示技术制备条形码蛋白,实现蛋白与其编码cDNA序列的共价偶联;通过原位邻近连接技术将互作的条形码蛋白与调控的DNA片段进行固定形成可扩增DNA标签序列,该标签序列实现了蛋白质的序列信息向核酸序列信息的转变;借助巢式PCR方法,通过测序解码DNA标签序列,获得转录调控复合物之间的互作信息。同时根据串联亲和纯化原理以及凝胶阻滞实验原理设计了固相/液相两种不同的筛选方式,从而适用于不同的测定样本。论文首先选取c-Fos/c-Jun转录调控复合物作为研究对象,采用固相/液相两种筛选方式,对于One-Pot-seq进行了原理性验证。测序后发现序列类型以及连接方式均符合预期,表明了One-Pot-seq方法的可行性以及筛选方式的特异性与鲁棒性,实现了在同一实验体系中同时平行测定蛋白-蛋白和蛋白-DNA的多种相互作用。其次,为了检验One-Pot-seq实验体系的高容量性,我们将c-Fos/c-Jun转录调控复合物体系的顺式调控元件与反式作用因子分别进行了随机合成与随机突变,实现了2 x 1013(顺式调控元件DNA)与2 x 1012(反式作用因子)两种高容量大库之间的有效筛选,同时结合动力学模拟以及凝胶阻滞实验(EMSA)对于结果可靠性进行了评价,结果表明了One-Pot-seq对于高库容筛选体系的适用性。最后采用TRE motif作为诱饵DNA片段对于小鼠肝脏全局条形码蛋白库进行了4次One-Pot-seq固相筛选,钓取其互作蛋白,将第四轮的样品库以及对照库转化载体分别随机挑取100个单克隆与20个单克隆进行初步测序,结果显示共捕获到的10对蛋白互作对,其中9对已经有相关文献报道支持,综上表明One-Pot-seq作为一种以核酸为核心的研究蛋白质与核酸互作的方法,对于研究“真实”核酸与蛋白质相互作用同样具有可行性。