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目的:癌症是世界范围的公共健康难题,逐年高升的发病率和死亡率令癌症成为导致人类死亡的重要原因。近年来,免疫疗法在癌症治疗领域有了突破性进展,但是由于该治疗方法的局限性和副作用,亟待寻找到更合适的标志物和治疗靶点,进而依照个体化原则评估适合免疫治疗的病人并不断优化治疗方案。高尔基体膜蛋白1(Golgi membrane protein 1,GOLM1)是位于高尔基体的膜蛋白,实验室的前期研究证实,血清GOLM1可作为早前筛查和诊断多种类型肿瘤的生物学指标,其中肝细胞肝癌病人血清中GOLM1水平显著高于正常人,并且其表达水平随疾病的进展而增加。结合既往文献和前期结果,本研究计划在组织学水平验证GOLM1在肿瘤局部的表达情况,并且深入探索GOLM1与肿瘤微环境中免疫系统组分改变的关联性,探究GOLM1在抗肿瘤免疫应答中扮演何种角色,为GOLM1作为生物标志物的转化应用提供理论支持。方法:为了评估GOLM1在肿瘤局部的表达情况以及与其相关的临床病理特征,我们收集了 161例原发性肝细胞肝癌病人的肿瘤组织样本和100例有明确病理诊断的肝脏良性疾病和癌旁组织样本,根据组织芯片GOLM1和CD8的免疫组化染色评分以及病人的病理诊断结论和随访的生存信息,进行统计学分析;为了证明GOLM1缺失能抑制肿瘤生长,并且这种抑制作用具有免疫依赖性,在体内实验中,我们分别选取BALB/c、C57BL/6小鼠和裸鼠,皮下接种野生型、Golml+/+、Golml+/-和Golml-/-的H22小鼠肝癌细胞和MCA205小鼠纤维肉瘤细胞,绘制肿瘤生长曲线;为了探索GOLM1缺失能否引起肿瘤局部的免疫应答改变,我们构建了小鼠皮下瘤模型,并在接种肿瘤后第十天取瘤块剥离处理,分别通过流式细胞染色、免疫组化和酶联免疫斑点实验检测肿瘤微环境内免疫细胞组分和胞内细胞因子的比例变化;通过转录组测序分析GOLM1缺失后肿瘤的差异表达基因,然后利用qPCR实验验证相关基因的表达,并在敲除小鼠模型中进行验证GOLM1缺失与干扰素通路的关联;为了研究GOLM1缺失与肿瘤细胞免疫原性物质释放增多的关系,以蒽环类化疗药处理肿瘤细胞,通过流式细胞术和化学发光实验等方法检测肿瘤细胞凋亡、钙网蛋白暴露、HMGB1分泌和ATP释放的情况;进一步,在Golml-/-细胞基础上敲除自噬关键基因Atg5和过表达ATP水解酶CD39,研究GOLM抑制肿瘤免疫应答是否与自噬依赖的ATP释放有关;为了探索GOLM1抑制与自噬和自噬相关通路的关系,我们在GOLM1缺失细胞基础上构建RFP-GFP-LC3过表达的细胞系,通过免疫荧光观察自噬流的改变、Western blot检测AKT/mTOR与自噬相关通路中各种关键蛋白的表达水平。结果:(1)通过免疫组化检测良性疾病肝组织、癌旁肝组织和肝癌组织,我们发现,相比于对照组织,GOLM1在肿瘤组织中表达水平明显增高,并且肿瘤组织中CD8与GOLM1的表达水平呈现负相关。结合临床资料分析,GOLM1表达水平与肿瘤分化程度呈现负相关,GOLM1高表达病人远期存活率更低。(2)将WT、Golm1+/+、Golm1+/-和Golm1-/-H22和MCA205肿瘤细胞注射到小鼠皮下,GOLM1缺失对不同品系的小鼠肿瘤生长都有显著抑制作用,但是在裸鼠中GOLM1缺失不能抑制肿瘤生长。Golm1-/-肿瘤内浸润的CD4+T细胞和CD8+T细胞数量明显增多,MHC-ⅡhiCD11c+树突状细胞、MHC-ⅡhiF4/80+巨噬细胞、CD11b+Ly6ChiLy6G-髓样细胞比例上调,分泌IFNγ的CD4+T细胞和CD8+T细胞比例也显著增加。(3)GOLM1缺失的肿瘤局部产生更多IFNγ,生物信息学分析提示,GOLM1与干扰素信号通路相关,GOLM1缺失引起Ifnar、Ccl4和Cxclll等基因上调,并且GOLM1缺失不能抑制Ifnar-/-小鼠的肿瘤生长。(4)在蒽环类化疗药作用下,GOLM1缺失后细胞早期凋亡增加,Cleaved-Caspase8 和 Cleaved-PARP 表达上调,c-FLIP 表达下调,HMGB1 和ATP向胞外释放增多。敲除Atg5会阻断GOLM1缺失引起的ATP释放增多,并且过表达ATP水解酶CD39后,GOLM1缺失不再能抑制肿瘤生长。(5)饥饿条件下观察自噬流变化,与对照细胞相比,Golm1-/-细胞自噬发生明显增多,自噬相关蛋白Beclin1、ATG7表达上调,自噬受体SQSTM1/p62减低,LC3B-II/LC3B-I增加。此外,抑制GOLM1能影响AKT/mTOR通路相关蛋白表达,使得AKT和mTOR磷酸化减少,ULK1、ATG13和FIP200表达上调。结论:GOLM1不仅可以作为癌症早期诊断和预后评估的重要标志物,并且GOLM1缺失通过AKT/mTOR通路介导自噬增加,引起自噬依赖的ATP释放增多,继而提升肿瘤微环境内死亡细胞的免疫原性,增强免疫系统的识别和杀伤肿瘤作用。已知肿瘤治疗的疗效依赖于肿瘤细胞的免疫原性来触发抗肿瘤免疫反应,因此,GOLM1有望作为潜在的肿瘤筛查指标和免疫检查点抑制剂靶点,为癌症诊断和治疗提供新的思路。