论文部分内容阅读
S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAMs)基因是目前众多逆境胁迫蛋白质组学和转录组学新发现的一个参与植物耐逆性的重要基因,其蛋白合成产物S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAM)是一种极其重要的活性代谢物质,广泛参与逆境胁迫下核酸、蛋白质、磷脂等化合物的形成,同时还是多胺和乙烯合成的前体物质。然而,SAMs基因在逆境胁迫下的具体功能及其调控机制尚不清楚。本研究以盐敏感的黄瓜品种’津春2号’为材料,采用qRT-PCR方法分析了CsSAMs对不同逆境胁迫和激素的响应,克隆黄瓜CsSAMs基因启动子,并对其序列及功能进行分析验证,鉴定该启动子序列中响应盐胁迫的功能作用元件,并运用酵母单杂交技术筛选鉴定与该功能作用元件互作的上游转录因子,为深入阐明黄瓜CsSAMs基因在盐胁迫下的转录调控机理提供理论基础。主要研究结果如下:1.qRT-PCR分析表明,CsSAMs基因不仅能够响应盐胁迫,而且还受干旱、高温等胁迫条件的诱导。ABA、MeJA和GA3能上调CsSAMs基因表达,而SA处理抑制了该基因的表达。根据NCBI数据库获得了黄瓜CsSAMs基因5’上游序列,设计引物并克隆了 1742 bp启动子,生物信息学分析显示该序列含有多个TATA-box和CAAT-box,此外,该序列存在多个响应盐胁迫的GT-1元件,参与干旱胁迫的MYB结合位点及其他非生物胁迫诱导元件、激素响应元件以及内源调控作用元件。基因定量与启动子功能预测结果表明黄瓜CsSAMs基因属于胁迫响应基因,其转录水平还受到多种激素的调控。2.以野生型烟草NC89为材料,采用启动子5’端缺失方法,将不同长度启动子片段(1742bp、1501bp、1162bp、750 bp、321 bp)正向取代植物表达载体pCAMBIA1303中的35S启动子并运用农杆菌介导法侵染烟草叶盘,成功筛选不同长度启动子转化阳性再生烟草植株P0、P1、P2、P3和P4。对P0转基因苗各个组织进行GUS染色验证启动子表达谱,同时对缺失载体转化苗进行胁迫和激素诱导,鉴证启动子功能区并进一步确定响应盐胁迫的区域。结果表明CsSAMs启动子为诱导型启动子而非组织特异性启动子,-1742～-1500 bp的区域能明显被盐胁迫诱导,该区域的三个GT-1元件可能发挥着重要作用。3.根据拟南芥盐响应蛋白AtGT-3b氨基酸序列,采用系统发育树分析,初步筛选3个黄瓜GT类蛋白,并对其进行克隆和功能验证。qRT-PCR结果表明CsGT-3b基因在盐胁迫下30min根和叶的表达量分别是对照的35.87和10.13倍,1 h后均达到最大值,分别为对照的112.26和108.39倍。蛋白质结构分析发现CsGT-3b含有一个DNA结合域—SANT结构域,初步预测该转录因子蛋白能结合特定顺式作用元件,调控下游基因的表达。4.运用酵母单杂交方法,鉴定转录因子CsGT-3b与CsSAMs基因启动子的盐诱导元件GT-1的互作。结果表明CsGT-3b能特异性的结合GT-1元件,激活报告基因表达。亚细胞定位显示CsSAMs蛋白主要定位于细胞质中而CsGT-3b蛋白定位于细胞核内。以上结果表明盐胁迫诱导CsGT-3b蛋白与CsSAMs启动子内的GT-1元件的结合,调控了CsSAM 基因的表达。