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泛素-蛋白酶体是普遍存在于生物体各组织内的蛋白降解通路,它参与了几乎所有动植物体的生命活动,包括细胞增殖、分化;细胞周期调控;膜受体内吞作用;基因的转录与表达等方面,它能通过降解其他通路的抑制因子或激活因子从而调控通路的进程。为了研究该通路在斑节对虾卵巢发育过程中的功能,本研究克隆验证了28泛素家族基因的开放阅读框,其中包括1个泛素前体、5个泛素类似物、2个泛素活化酶、14个泛素结合酶、3个泛素连接酶和3个泛素羧基末端水解酶。利用荧光定量PCR技术检测了这28个基因在斑节对虾性腺不同发育时期的卵巢和肝胰腺中的表达,结果显示在卵巢发育中各基因的表达趋势大体上分为三支,有8个基因的表达总趋势上升(UBE3S、UBE2N、UBFD1、UBE2G1、UBE2J2、UFM、UFM1、UBE2H1);7个基因的表达总趋势下降(UMAE5、UBE、UPL、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3);10个基因的表达呈先升后降的趋势(UCH14、UBE2V2、UBE2Q1、UBE2A、UBE2G2、UBA1、UBE2H、UBE3B1F1、UBE2C、UBE2H5b)。各基因在卵巢不同发育期对应的肝胰腺中的表达结果显示基因的表达趋势大体上分为三支,有12个基因的表达总趋势先降后升(UBE3S、UBE2N、UFM、UBFD1、UBE、UBE2A、UPL、UBE2G1、UBA1、UBE3B1F1);2个基因的表达总趋势上升(UBE2V2、UBE2H1);14个基因的表达呈先降后升,再降的趋势(UCH14、UBE2Q1、UBE2G2、UBE2H、UBE2C、UBE2H5b、UMAE5、UCHIL5、UBS30、UDCP2、ULP3、UBE2J2、UFM1、UBE2)。根据结果筛选出泛素前体(UBS30)、泛素活化酶E1(UBA1)、泛素结合酶E2(UBE2A、UBE2G1、UBE2G2和UBE2H)6个基因进行进一步的蛋白功能分析。PmUBS30全长为933 bp,开放阅读框为396 bp,编码131个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在胃中表达量最高,心脏次之;构建体外重组表达体系,1mmol/L IPTG、25℃诱导6小时可得到33.5kD左右目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,蛋白浓度为3.13μg/μl。PmUBA1全长为3822 bp,开放阅读框为3120 bp,编码1039个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官和胃中表达量最高,鳃次之;构建体外重组表达体系1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为34kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度为3.20μg/μl;利用重组蛋白制备多克隆抗体,免疫组织化学结果显示UBA1在斑节对虾卵巢不同发育时期中的卵巢中主要定位于细胞质中,且在III期、IV期、V期卵巢中表达较为明显,I期和II期卵巢中无明显表达。PmUBE2A全长为941 bp,开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官表达量最高,胃组织次之,其次是鳃、心脏;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为38 kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度约为2.08μg/μl。PmUBE2G1全长为911 bp,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸;荧光定量结果显示该基因在淋巴器官、鳃组织和胃组织中表达量最高,心脏次之;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为38 kD的目的条带,Western Blot验证目的条带。PmUBE2G2得到片段长为620 bp,开放阅读框为507 bp,编码168个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官和胃中表达量最高,肝胰腺次之,与鳃和心脏组织的差异不显著;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为38kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度约为2.66μg/μl。PmUBE2H得到片段长为1010 bp,开放阅读框为555 bp,编码184个氨基酸;荧光定量PCR结果显示该基因在淋巴器官表达量最高,鳃次之;1mmol/L IPTG、30℃诱导6小时可得到其核心区域约为39kD的目的条带,Western Blot验证目的条带后进行蛋白纯化,浓度约为2.92μg/μl。本实验通过研究泛素家族基因在斑节对虾性腺不同发育时期的卵巢和肝胰腺中的表达,推断这些基因分别参与斑节对虾卵巢卵母细胞分化及卵黄蛋白积累,同时参与肝胰腺卵黄蛋白原的合成及转运。并筛选6个各类基因进行进一步的蛋白功能研究,为进一步研究泛素基因家族在斑节对虾卵巢发育中的调控机制提供参考。